Дополнительный материал на тему: «БИОХИМИЯ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ (СМЕШАННОЙ СЛЮНЫ). МЕТАБОЛИТЫ И ФЕРМЕНТЫ СЛЮНЫ»

Дополнительный материал на тему:  «БИОХИМИЯ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ  (СМЕШАННОЙ СЛЮНЫ). МЕТАБОЛИТЫ И ФЕРМЕНТЫ СЛЮНЫ» Слюна,   или,   правильнее,   ротовая   жидкость,   является   очень   доступным объектом   исследования   на   школьном   уроке   химии.   Получить   ее,   как говорится, плевое дело. Здоровый молодой человек без особых усилий путем многократного   сплевывания   за   несколько   минут   наберет   до   4–5   мл   этой биологической   жидкости.   Но   столько   ротовой   жидкости   нам   и   не понадобится. Строго говоря, слюной называется только секрет трех пар слюнных желез (околоушных,   подчелюстных,   подъязычных).   В   полости   рта   слюна смешивается   с   секретом   слизистой   оболочки   рта,   слущенными   клетками эпителия,   а   также   большим   количеством   бактериальных   клеток,   которые постоянно   обитают   на   слизистой,   деснах,   зубах.   Уровень   бактериальной обсемененности полости рта значительно варьирует. Подсчитано, что в 1 мл ротовой жидкости содержится от 40 млн до 5,5 млрд микробных тел. По насыщенности   микроорганизмами   полость   рта   уступает   только   толстому кишечнику. Не случайно, ведь первыми микроорганизмами, которые наблюдал в свой микроскоп голландец Антоний Левенгук в 1683 году, были как раз микробы   зубного   налета.   В   полости   рта   выявлено   свыше   300   видов микроорганизмов.   В   основном   это   анаэробы:   стрептококки   и   другие микрококки,  фузобактерии,  а  также   некоторые   простейшие  грибы.  В 1892 году немецкий микробиолог Миллер опубликовал монографию о микрофлоре полости рта. Все   это   наводит   на   мысль   о   том,   что   ротовая   жидкость   может рассматриваться   как   доступная   модель   микробного   биоценоза.   Если   мы заинтересовались   жизнью   и   деятельностью   наших   друзей   бактерий,   нам необязательно   готовить   питательные   среды   и   в   стерильных   условиях выращивать   микроорганизмы,   что,   конечно,   мало   реально   в   школьных условиях. Достаточно наплевать в пробирку, и вот уже миллиарды микробов готовы для изучения. Высокая плотность микробных тел, теплая, влажная и нейтральная   среда   способствуют   активным   метаболическим   реакциям   в полости рта, и поэтому же химический состав ротовой жидкости существенно отличается от состава, например, плазмы крови, лимфы, тканевой жидкости. В   табл.   1   приводится   химический   состав   типичной   ротовой   жидкости здорового человека.Химический состав ротовой жидкости Процент Компонент Таблица 1 Сухой остаток Белки Аммиак Мочевина Аминокислоты Глюкоза Неорганические фосфаты Кальций Холестерин Хлориды Молочная кислота 0,1–1,0 0,08–0,6 0,002–0,01 0,011 0,013 0–0,02 0,007–0,02 0,004–0,01 0,003–0,015 0,04–0,07 0,054 Исследование   образцов   ротовой   жидкости   можно   проводить   по   двум направлениям: 1. Определение химических компонентов (метаболитов). 2. Анализ активности ферментов как хозяина – человека, так и сожителей – микробов. Доступные анализу в школьных условиях компоненты слюны – это аммиак, мочевина, сумма аминокислот (аминоазот). Эти анализы выполняются так же, как при исследовании кожных смывов (см. выше), и для анализа потребуется не более 0,1–0,2 мл слюны, которые разводятся до 1–2 мл водой. С ротовой жидкостью можно проделать и реакции на отдельные аминокислоты (аргинин, гистидин, тирозин). Техника этих определений также описана выше. Как видно из таблицы 1, содержание аммиака в ротовой жидкости в 200– 1000 раз превышает его уровень в крови. Другими словами, здесь ситуация точно   такая   же,   как   и   на   коже.   Очевидно,   что   в   ротовой   полости   идут процессы   биосинтеза   аммиака   при   участии   бактериальных   ферментов.   Из чего, из каких субстратов образуется аммиак слюны, в общем, достаточно ясно. Это, во­первых и главных, мочевина, уровень которой поэтому в слюне в 2–3 раза ниже, чем в крови и тканях. Надо принять, что микроорганизмы ротовой полости содержат гидролизующий мочевину фермент. Кроме того, аммиак образуется в слюне за счет реакций дезаминирования аминокислот и их амидов. А зачем нужен аммиак в ротовой жидкости? По крайней мере, по двум причинам.   Во­первых,   аммиак   является   пищевым   субстратом   для разнообразных   и   многочисленных   бактерий   ротовой   полости:   они   его используют   для   синтеза   собственных   азотистых   соединений,   в   том   числе белков и нуклеиновых кислот. Во­вторых, бактерии ротовой полости активноокисляют   углеводы   с   образованием   органических   кислот,   например, молочной, угольной, что ведет к нарушению кислотно­щелочного баланса, т. е. закислению   слюны.   Образующийся   аммиак   частично   нейтрализует органические кислоты слюны. То,   что   в   ротовой   жидкости   действительно   активно   гидролизуется мочевина,   можно   легко   убедиться   (см.   опыты   с   ферментами   ротовой жидкости). Создается впечатление, что биохимические процессы в ротовой полости не отличаются от таковых на кожных покровах. Это не совсем так, поскольку сообщество   микробов   во   рту   более   разнообразно.   В   частности,   в   ротовой жидкости   практически   всегда   обнаруживаются   тиоцианаты   (роданиды),   а также нитриты. Что касается первых, то по литературным данным содержание их в слюне составляет 30–50 мг на 1 л, у курильщиков – в 3–4 раза выше. Однако мы не смогли подобрать наглядную реакцию на тиоцианат­анионы, подходящую для условий школьного урока. Известная реакция с хлоридом железа   оказалась   недостаточно   чувствительной   для   некурящих.   Иное   дело нитриты. Определение солей азотистой кислоты в ротовой жидкости легко выполнить на уроке по химии.  О п р е д е л е н и е  н и т р и т о в  в  р о т о в о й  ж и д к о с т и Для   анализа   потребуется   0,5–1,0   мл   слюны   и   уксуснокислый   раствор реактива   Грисса.   Реактив   Грисса   –   это   имеющийся   в   продаже   сухой кремового   цвета   порошок,   с   неприятным   запахом,   представляющий   собой смесь   сульфаниловой   кислоты   и   1­нафтиламина.   Его   можно   много   лет хранить в темном, хорошо закупоренном флаконе, его раствор в 20 %­ной уксусной   кислоте   также   весьма   устойчив.   Первоначально   реактив   был предложен   Гриссом   еще   в   1858   году   как   чувствительный   аналитический реагент на присутствие нитрит­анионов. Немецкий химик Иоганн Петер Грисс вообще   внес   большой   вклад   в   развитие   химии   красителей   (реакции диазотирования и азосочетания). О п ы т. К объему свежесобранной слюны добавляем 1–2 мл воды и 1 мл 1 %­ного   раствора   реактива   Грисса,   приготовленного   на   20  %­ной   уксусной кислоте.   Если   нитритов   в   образце   много,   пурпурная   окраска   постепенно развивается   уже   при   комнатной   температуре,   однако   лучший   результат получается   при   нагревании   в   горячей   водяной   бане   5–10   минут. Интенсивность окрашивания пробы от бледно­розового до ярко­пурпурного в зависимости от уровня нитритов в пробе. Больше нитритов обнаруживается после овощных блюд (особенно петрушки, сельдерея и т. п.), овощных соков. Слюна вегетерианцев, как правило, более богата нитритами.Существует   общее   мнение,   что   овощная   диета   более   полезна.   Но оказывается, что полезные овощи вызывают повышение нитритов в слюне (и далее   в   желудочно­кишечном   тракте).   Нитриты,   как   известно,   довольно ядовитые соединения, вполне возможно, что они являются причиной раковых заболеваний желудка. Что же получается, что и овощи есть вредно?  Дело   в   том,   что   в   овощах   содержится   довольно   много   солей   азотной кислоты, нитратов. Сами по себе нитраты не столь токсичны, как нитриты. И человек с пищей и питьем ежедневно получает до 200–300 мг нитратов.  В   таблице   2   представлены   цифры   содержания   солей   азотной   кислоты (нитратов) в некоторых общеупотребительных овощах, а также в речной воде. Кстати,   принятая   в   Российской   Федерации   предельно   допустимая концентрация (ПДК) нитратов в питьевой воде соответствует 50 мг на 1 л. Содержание нитратов в овощах Таблица 2 Овощи Капуста Огурцы Томаты Лук ранний Лук поздний Кукуруза Речная вода Картофель Свекла Перец сладкий Листовая зелень Яблоки Дыни Мг на 1 кг сырой массы 500–900 100–300 50–100 1200 100–120 100–1700 11–15 250 1400 200 2000 60 90 Содержание нитратов в растительной продукции, как видно из таблицы, подвержено   существенным   колебаниям.   Это   связано   с   неумеренным внесением нитратных удобрений. Как правило, высокое содержание нитратов отмечено   в   ранних   парниковых   овощах   (сравни   в   таблице   лук   ранний   и поздний).   Однако   вопросы   сельскохозяйственной   химии   –   это   предмет отдельного разговора. Интереснее   выяснить,   чем   опасно   употребление   повышенных   количеств нитратов.   Очевидно,   что   их   опасность   во   многом   связана   с   тем,   что   в желудочно­кишечном   тракте   под   действием   микроорганизмов   происходит восстановление нитратов до нитритов (и далее до аммиака). Биологическая подоплека этого процесса состоит в использовании кишечными бактериями нитратной   формы   азота   для   биосинтеза   собственных   белков,   нуклеиновых кислот   и   других   важных   азотсодержащих   соединений.  Определенная   частьобразующихся нитритов не успевает восстанавливаться дальше до аминного азота, и поэтому, как описано в опыте 11, мы можем их обнаружить в ротовой полости   (в   слюне),   где   также   происходит   бактериальное   восстановление нитратов. Дальнейшая судьба нитритов  слюны такова: они попадают в кислотную среду   желудка   и   там   участвуют   в   реакциях   образования   нитрозаминов. Последние, как известно, получаются при реакции нитритов с вторичными аминами. Ниже приводится подобная реакция с иминокислотой пролином: Аналогичным   образом   могут   нитрозироваться   азотистые   основания нуклеиновых   кислот   (аденин,   гуанин,   тимин   и   др.),   а   это   уже   путь   к генетическим мутациям и далее к перерождению клеток слизистой желудка и кишечника, т. е. раковым заболеваниям. Надо отметить, что ткани высших животных не способны восстанавливать нитраты  и  обнаружение   где­либо   в  организме   такой  реакции (и  появление нитритов) однозначно свидетельствует о возникновении здесь бактериального очага,   об   обсеменении   этой   части   организма   бактериями.   На   этом медицинском   постулате   основана,   например,   диагностика   почечных инфекционных заболеваний: обнаружение в свежей моче нитритов говорит о бактериальной   инфекции   в   мочевыводящих   путях.   Итак,   эти   зловредные бактерии ко всему прочему еще и отравляют организм нитритами. Не стоит, однако, так уж клеймить бактерии: они ведь должны расти и размножаться, а нитраты и нитриты – это, между прочим, их пища. В одной серьезной научной статье   мне   удалось   натолкнуться   на   шутливые   «законы   микробиологии», предложенные   американским   бактериологом   Дэвидом   Перлманом.  Вот   эти «законы»: 1. Микроб всегда прав; он твой друг и чуткий товарищ. 2. Глупых микробов не бывает. 3. Микробы всесильны и способны на все. 4. Микробы умнее, сообразительнее и энергичнее любого ученого­химика, инженера. 5. Помоги микробу, и он поможет тебе. Для микроорганизмов человек – это просто среда обитания, экологическая ниша, в которой они живут и развиваются. Подсчитано, что человек состоит примерно из 8 триллионов клеток, и при этом он содержит в своем теле более 100 триллионов бактериальных клеток. Микроб живет на человеке примернотак же, как человек живет на планете Земля. И как необразованный глупый человек   может   вредить   своей   планете,   так   и   «глупый»   микроб   может навредить и даже погубить свою среду обитания – организм человека. Правда, глупых микробов не бывает (см. закон 2). Ф е р м е н т ы  р о т о в о й  ж и д к о с т и Можно   было   бы   сразу   перейти   к   изложению   техники   опытов   по обнаружению   ферментов   в   смешанной   слюне.   Но,   наверное,   сначала   надо сделать краткий экскурс в область энзимологии, то есть науки о ферментах. Кстати,   почему   специалистов   по   ферментам   называют   энзимологами,   а   не ферментологами? Это связано с тем, что законодатели мод в современной биохимии – американцы и англичане – говорят не ферменты, а энзимы.   Итак,   что   же   такое   ферменты   (энзимы)?   Ферментами   называются биологические   катализаторы   белковой   природы,   ускоряющие,   точнее регулирующие,   химические   реакции   в   биологических   системах.   Белковая природа   ферментов   четко   доказана   еще   в   30­е   годы   ХХ века,   когда   были очищены и получены в кристаллическом виде такие ферменты, как уреаза, пепсин,   папаин,   рибонуклеаза   и   др.   Поскольку   ферменты   являются протеинами,   для   них   характерны   типичные   свойства   белков   (протеинов). Например, при нагревании свыше 50–60о С ферменты теряют свою активность из­за необратимого нарушения нативной структуры белковой молекулы. Это свойство   ферментов   называют   термолабильностью.   Активность   ферментов существенно зависит от реакции среды. Кислая и щелочная среда, так же как температура, изменяет структуру сложной макромолекулы фермента. Отсюда полная или частичная утрата функции фермента, его активности. Молекула белка­фермента,   естественно,   очень   велика.   Так,   например,   молекулярная масса фермента уреазы 480 000 дальтонов, а молекулярная масса субстрата мочевины   только   60   дальтонов;   каталазы   –   250   000,   а   каталазы,   которую разлагает пероксид водорода, – 34 дальтона. Ясно, что на огромной молекуле фермента должен быть какой­то небольшой участочек, где и разыгрывается каталитический акт. Эта область фермента называется  активным центром. Ситуацию с ферментами легко объяснить на таком примере: я печатаю этот текст   пальцами   правой   руки,   можно   сказать,   что   эта   часть   тела   является активным центром акта печатания. Или: я просматриваю текст, и глаза есть активный центр этого действия. Каждому понятно, что для этих действий нужны и другие части тела – одни пальцы, скажем, без головы ничего бы не напечатали. Так и с ферментами. Для их функционирования нужна целиком вся молекула фермента, но само каталитическое действие происходит именно в   активном   центре.   Такое   положение   позволяет   эффективно   влиять   на активность   фермента.   Например,   добавив   в   раствор   фермента   небольшое количество   похожего   на   субстрат   вещества,   мы   можем   заблокировать (отравить)   активный   центр,   и   фермент   не   сможет   выполнять   своюестественную   функцию.   Такие   вещества   называются   ингибиторами,   и   их широко применяют, например, в медицинской практике. Можно утверждать, что   применяемые   лекарства –  в   конечном   счете   ингибиторы   определенных энзиматических реакций, равно как и яды – это тоже ингибиторы жизненно важных ферментных систем. Энзимология, по моему глубокому убеждению, самая   интересная   область   современной   биоорганической   химии   или молекулярной биологии. В рамках школьной программы можно предложить ряд   работ   по   энзимологии.   В   нашем   случае   источником   ферментов   будет опять­таки ротовая жидкость. О б н а р у ж е н и е  ф е р м е н т о в  в  р о т о в о й  ж и д к о с т и Принципиальный   подход   к   обнаружению   того   или   иного   фермента   в биологической   жидкости   состоит   в   том,   что   предполагаемый   источник фермента (в нашем случае смешанная слюна) какое­то время выдерживается (инкубируется) с веществом, на которое действует фермент (субстратом), и затем   в   конце   инкубации   определяется   появление   продукта   реакции   либо исчезновение (убыль) субстрата. При этом необходимо создать оптимальные условия   для   проведения   ферментативной   реакции:   подходящая   реакция среды, оптимальная температура, добавление кофакторов реакции. Простой пример:   для   определения   активности   фермента   желудочного   сока  пепсина надо кроме белкового субстрата добавить 0,1 М соляной кислоты, поскольку этот фермент работает в кислой среде. В   простом   «школьном»   варианте   используется   экологический   подход: образец биологической жидкости просто инкубируется с субстратом, как это происходит в организме, при этом мы не создаём оптимальных тепличных условий для фермента. По происхождению ферменты ротовой жидкости можно подразделить на «человеческие»   и   бактериальные.   К   первым   можно   отнести,   например, амилазу (раньше она называлась птиалином), лизоцим или мурамидазу и др. Амилаза   слюны   синтезируется   непосредственно   в   слюнных   железах   и является идеальным объектом для демонстрации ферментативной активности в школьном и вузовском курсе. Процедура анализа очень проста. К 0,2–0,5 мл слюны   добавить   1   мл   разбавленного   раствора   крахмала.   После   15–20­ минутной инкубации уже можно установить, что в слюне есть амилаза. Дело в том,   что   амилаза   гидролизует   крахмал   согласно   следующему   уравнению реакции: (С6Н10О5)n + nН2О = nС6Н12О6 Сам крахмал, как хорошо известно, дает очень чувствительную реакцию с йодом – синее окрашивание. Под действием амилазы крахмал расщепляется до   олигосахаридов,   которые,   естественно,   не   дают   реакции   с   йодом. Амилазная активность в слюне довольно высокая, и этот опыт получается безпроблем. Единственное замечание: концентрация крахмала должна быть очень низкая.  Если   крахмала   будет   много,  он   не   успеет   весь   гидролизоваться   и синее окрашивание после инкубации сохранится. Чтобы не попасть впросак, учителю   надо   проделать   опыт   заранее,   подобрав   время   инкубации   и концентрацию крахмала. С   амилазой   можно   выполнить   целый   ряд   опытов   по   изучению   свойств ферментов. Например, посмотреть, как влияет температура и реакция среды на   скорость   гидролиза   крахмала   амилазой.   Или:   тормозят   ли   активность фермента соли тяжелых металлов.  Непонятна,   между   прочим,   функция   слюнной   амилазы,   ведь   в   ротовой полости пища не задерживается и процесс переваривания крахмала пищевых продуктов происходит в тонком кишечнике. Зачем же тогда амилаза в слюне?  Ф е р м е н т ы  м и к р о о р г а н и з м о в   р о т о в о й   ж и д к о с т и Бактериальные   ферменты   в   ротовой   полости   разнообразны   и многочисленны.  О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ УРЕАЗЫ  Ротовая   жидкость   инкубируется   с   1–3   %­ным   раствором   мочевины.   В пробу добавлено несколько капель универсального индикатора. Результат: за счет   образования   аммиака   проба   подщелачивается   и   цвет   индикатора изменяется   от   желто­зеленого   до   синего.   Можно   использовать   другие индикаторы   с   зоной   перехода   окраски   в   нейтрально­слабощелочном диапазоне.   Реакцию   можно   наблюдать   в   динамике   через   определенные интервалы   инкубации.   Физиологический   смысл   бактериальной   уреазы   –   в использовании   мочевины   слюны   человека   как   питательного   субстрата   для микробов.   Аналогичный   процесс   интенсивно   происходит   в   толстом кишечнике и в рубце жвачных животных. Кроме того образующийся аммиак (щелочной продукт) участвует в нейтрализации органических кислот ротовой жидкости.   Последние   накапливаются   в   ротовой   полости   в   результате действия бактериальных ферментов брожения углеводов. Об этом следующий опыт. О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ К ротовой жидкости добавляем раствор какого­либо из сахаров (глюкоза, фруктоза,   сахароза,   лактоза   и   др.)   и   несколько   капель   универсального индикатора. После часовой инкубации (а возможно, и раньше) наблюдается постепенное изменение окраски индикатора до желтого и далее до желто­ оранжевого.   Можно   использовать   другие   индикаторы,   у   которых   зона перехода   в   слабокислой   среде.   По­видимому,   основной   органическойкислотой,   образующейся   из   углеводов   в   ротовой   жидкости,   является молочная   кислота.   Можно   попробовать   ее   обнаружить   после   инкубации слюны   с   углеводами   реакцией   с   хлоридом   железа.   Инкубируя   ротовую жидкость   с   различными   углеводами,   можно   установить,   что   они расщепляются с разной скоростью. Наиболее быстро расщепляется глюкоза и, таким образом, закисляет ротовую полость. А похожая на глюкозу пентоза под названием ксилоза практически не метаболизируется бактериями. В связи с   этим   нетрудно   догадаться,   почему   в   «Орбит»   добавляют   ксилозу   или ксилит, но не глюкозу или сахарозу. О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АРГИНАЗЫ К   объему   ротовой   жидкости   добавить   раствор   аминокислоты   аргинина. Происходит   следующая   ферментативная   реакция   (фермент   называется аргиназой): аргинин + вода = орнитин + мочевина. То, что в ротовой жидкости есть аргиназа, определяем по увеличению в пробе продукта реакции мочевины. Для наглядности следует поставить пробу с   ротовой   жидкостью   без   аргинина,   так   как   в   слюне   есть   небольшое количество   фоновой   мочевины.   Физиологическое   значение   этого   фермента состоит в использовании бактериями белкового аргинина как энергетического субстрата.  Кроме   того,  из   образующегося  орнитина  синтезируются   важные полиамины, которых в слюне значительно больше, чем в крови. О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРАТРЕДУКТАЗЫ К   0,1–0,2   мл   ротовой   жидкости   добавляем   несколько   капель   0,01 М раствора нитрата натрия (годятся также соли калия, аммония, магния). Проба инкубируется 20–30 минут в водяной бане при температуре около 40о С. Для сравнения   ставится   еще   одна   проба   с   тем   же   количеством   слюны,   но   без нитрата. Как показано выше, в ротовой жидкости и так присутствует немного нитрита. А ведь именно по нарастанию концентрации нитрита мы судим о наличии в слюне бактериальной нитратредуктазы. Определяем появление (или нарастание) нитрита с помощью уже описанной цветной диазореакции Грисса: в пробе с нитратом будет ярко­пурпурное окрашивание, а в пробе без нитрата – бледно­розовое или вообще проба будет бесцветной. Определение фермента нитратредуктазы в ротовой жидкости по указанной прописи получается очень хорошо и надежно. Высокая активность этого фермента говорит о том, что в ротовой   полости   содержится   много   микроорганизмов,   восстанавливающих минеральные   нитраты   пищевых   овощей.   Низкая   активность   наблюдается после   чистки   зубов   пастой,   после   полоскания   рта   дезинфицирующими растворами.   Соли   тяжелых   металлов,   в   том   числе   и   нитраты,   а   такжеантибиотики,   как   и   следовало   ожидать,   резко   тормозят   активность бактериальной нитратредуктазы. Достаточно легко выполнить в классе такую почти экспериментальную работу: собрать образцы слюны у 9–10 школьников, проинкубировать их равные объемы с нитратом натрия одинаковое время и провести   реакцию   Грисса.   Различие   в   интенсивности   окрашивания   проб позволяет   оценить   количество   бактерий   в   ротовой   полости   разных школьников, так сказать, гигиенический статус рта школьника. И с с л е д о в а н и е  н и т р и т р е д у к т а з ы Образующиеся   в   ходе   предыдущей   реакции   нитриты   подвергаются дальнейшему   восстановлению,   хотя   и   с   меньшей   скоростью.   Это восстановление   идет   через   ряд   промежуточных   продуктов,   но   в   конечном счете   образуется   аммиак.   Следовательно,   если   мы   будем   инкубировать ротовую жидкость с раствором нитрита натрия (не путать с нитратом), то получим   в   опытной   пробе   прирост   аммиака.   Однако   можно   обнаружить активность нитритредуктазы и по убыли нитрита. Надо только использовать низкую концентрацию субстрата, чтобы его убыль была заметна. Здесь уместно сделать одно принципиальное замечание. Есть два подхода к исследованию   активности   любого   фермента.   Ее   определяют   по   убыли субстрата либо по прибыли продукта реакции. Можно сказать, что эти два подхода зеркально противоположны. Действительно, если в ходе химической реакции израсходовалось, допустим, 2 ммоля субстрата, то очевидно, что в реакционной системе появится 2 ммоля продукта. Выбор, каким способом определять активность фермента, зависит от методических возможностей и умения   исследователя.   Но,   в   принципе,   более   демонстративным   является способ   по   определению   прироста   продукта   реакции,   поскольку   в   нулевой момент   реакции   продукт   вообще   отсутствует,   и   его   появление   и   затем нарастание очень наглядно. Процесс восстановления нитратов в ротовой полости можно выразить в виде следующей последовательности реакций: NO3 –    NO2 –       NH2OH    NH3 О п р е д е л е н и е  п р о т е о л и т и ч е с к о й  а к т и в н о с т и Когда   образец   ротовой   жидкости   инкубируется   в   теплой   бане,   в   нем обнаруживается нарастание аминоазота, увеличение окраски с нингидрином. Если   же   в   пробирку   добавить   препарат   белка   (альбумин,   желатин   и   др.), прирост   аминоазота   ускорится   и   может   быть   выявлен   нингидриновой реакцией   после   40–60­минутной   инкубации.   Желательно   использовать ротовую   жидкость   натощак.   Физиологический   смысл   этого   процессадостаточно   ясен.   Микробы   гидролизуют   белок   слюны   хозяина   или добавленный специально белок как энергетический субстрат, а главное, для получения аминокислот, из которых они построят белки своих собственных клеток. Процессы протеолиза в ротовой полости, очевидно, усиливаются при воспалении. А в основе кариеса зубов лежит реакция гидролиза зубного белка (оссеоколлагена), и отсюда – разрушение структуры зубной ткани. О п р е д е л е н и е  д е к а р б о к с и л а з ы  а м и н о к и с л о т ы  о р н и т и н а  Бактерии   довольно   активно   лишают   различные   аминокислоты   их карбоксильной   группы   с  образованием   соответствующих   аминов.   Бактерии ротовой полости активно декарбоксилируют аминокислоту орнитин согласно реакции: орнитин     путресцин + СО2 Для   анализа   кроме   слюны   нужно   раздобыть   субстрат   L­орнитин   (что достаточно   проблематично).   Если   же   у   вас   есть   искомая   аминокислота, проинкубируйте ее с образцом слюны в течение 1–2 часов и затем в опытной пробе   определите   убыль   субстрата,   т.   е.   орнитина,   модифицированной нингидриновой реакцией Чинарда (процедура реакции будет описана ниже). Интересно,   что   в   ротовой   жидкости   содержится   относительно   высокий уровень   путресцина.   Этот   факт   установил   индийский   биохимик Гопалакришна.   Путресцин,   как   и   другой   диамин   кадаверин,   обладает неприятным гнилостным запахом (напоминающим запах изо рта). Но с другой стороны,   путресцин,   а   также   образующиеся   из   него   спермидин   и   спермин играют   важную   роль   в   формировании   и   функционировании   макромолекул нуклеиновых   кислот.   А   последние   участвуют   в   передаче   генетической информации и биосинтезе белков в клетке. К а т а л а з а  р о т о в о й  ж и д к о с т и К образцу слюны добавляется 1–3 %­ный раствор перекиси водорода, и проба инкубируется в теплой водяной бане. Параллельно ставится пробирка со слюной без перекиси (контрольная проба). В опытной пробирке замечается образование пузырьков кислорода согласно реакции: Н2О2  Н2О + О2 Среди   других   ферментов   ротовой   жидкости   кислая   и   щелочная фосфатазы,   которые   можно   определить   с   помощью   специальных   наборов (методики   достаточно   просты).  Нам   удается   определить   также   активность гликозидаз.   В   конечном   счете   может   создаться   впечатление,   что   в   слюнеможно определить почти все ферменты, что недалеко от истины (поскольку слишком разнообразен микробный состав этого секрета). Количественное определение ферментов ротовой жидкости имеет важное значение в стоматологии. Ясно, что при воспалении в полости рта изменяется состав микробной флоры и соответственно активность определенных энзимов. Предположим,   что   в   слюне   увеличивается   количество   ныне   модных геликобактерий, обладающих высокой уреазной активностью. Тогда скорость гидролиза мочевины в такой «патологической» слюне заметно возрастет, что можно выявить выше описанными методами. Представленные   материалы   показывают,   насколько   разнообразен химический   состав   живого   организма,   а   ведь   мы   проанализировали   лишь толику   веществ,   экскретирующихся   кожей,   содержащихся   в   ротовой жидкости.  Например,  мы   совершенно   не   затронули   аналитические   реакции большой   группы   жироподобных   веществ   (липидов),   хотя   на   коже   можно достоверно   обнаружить   присутствие   и   нейтральных   жиров (триацилглицеринов), и свободных жирных кислот, и холестерина, и других липидов.   Не   зря   же   существует   выражение   «жирная   кожа».   Липиды секретируются,   главным   образом,   сальными   железами   кожи   и   тонкой пленочкой   покрывают   практически   всю   поверхность   тела,   особенно   много липидов   экскретируется   в   волосистой   части   головы.   Липидная   пленка выполняет   важную   функцию   гидрофобной   (водоотталкивающей) биологической смазки, предохраняющей кожу от избыточного высушивания и слущивания рогового слоя. Кроме того, липидная смазка предохраняет белки кожных   покровов   (коллагены,   кератины   и   др.)   от   излишнего   контакта   с влажной водной средой, что привело бы к частичному набуханию этих белков и нарушению их естественной (нативной) структуры.  Легко   заметить,  что   кожа   плохо   смачивается   водой   (капли   воды   с   нее скатываются).   Смачивание   кожи   заметно   улучшается   после   воздействия растворов поверхностно­активных веществ, а попросту после мытья с мылом и   шампунями.   Возникает   санитарно­гигиенический   вопрос:   как   часто   надо мыться? Очевидно, на этот вопрос нет однозначного ответа. Очень часто – будет   повреждаться   защитная   липидная   пленка,   очень   редко   –   на   коже увеличивается   концентрация   экскретируемых   веществ,   выполняющих функцию   питательных   веществ   (нутриентов)   для   кожной   микрофлоры,   и далее   как   следствие   –   размножение   микроорганизмов,   в   том   числе   и патогенных. По­видимому, истина, как всегда, посередине.