Дополнительный материал на тему: «МОЧЕВИНА. ЕЁ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ»

Дополнительный материал на тему:  «МОЧЕВИНА. ЕЁ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ» Мочевина – это диамид угольной кислоты (NH2CONH2). Поскольку слово «мочевина» как бы неблагозвучно, предложено и другое название, так сказать, коммерческое, – карбамид.  Мочевина   –   одно   из   первых   органических   соединений,   которое   было синтезировано из минеральных веществ: знаменитый синтез Велера (1828 год). Велеровский   синтез   мочевины   из   цианата   аммония   рассматривается   как существенный   удар   по   теории   витализма,   которую,  кстати   сказать,  весьма поддерживал   тогдашний   законодатель   мод   в   европейской   химии   шведский ученый Я. Берцелиус. В настоящее время промышленный синтез мочевины на Земле исчисляется десятками тысяч тонн. Ее используют в качестве ценного азотного удобрения (почти 50 % азота), кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, для   получения   пластмасс   и   т.   п.   Мочевину   добавляют   в   зубную   пасту   и жевательную   резинку   (целесообразность   такой   добавки   можно   обсудить   с точки   зрения   биохимии).   Она   входит   в   состав   антисептического   средства «гидроперит».   В   медицинской   практике   мочевину   применяют   для   снятия отека мозга, токсического отека легких, при лечении глазных болезней. Однако,   на   наш   взгляд,   более   интересно   выяснить,   откуда   берется мочевина на коже человека. Можно начать несколько издалека. Как известно, пища человека (животных) состоит в основном из белков, жиров и углеводов. В   процессе   распада   (катаболизма)   жиров   и   углеводов     образуются исключительно диоксид углерода и вода согласно следующему обобщенному уравнению: CnH2nOn + nO2        nCO2 + nH2O Не так с белками. Они ведь еще содержат в виде аминогрупп азот, и перед организмом возникает важная проблема удаления белкового азота. Казалось бы, проще всего избавлять белки от азота путем реакции дезаминирования, т. е.   удаления   в   форме   аммиака.   Однако   это   негодный   вариант,   поскольку аммиак   оказывает   сильное   токсическое   действие   на   центральную   нервную систему.   Уже   в   концентрации   порядка   0,6   ммоль   он   вызывает   судороги, потерю сознания, кому. Кроме того, образующийся аммиак приводил бы к сильному   ощелачиванию   тканей.   Простой   расчет   показывает,   что   при потреблении 100 г белка в сутки в организме должно образоваться до 1 моля (16–17 г) аммиака. Напомним, что 1 моль – это 6,02  1023 молекул. Очевидно,в  организме наземных  животных должен  существовать  надежный   механизм обезвреживания   аммиака.   И   такой   механизм   действительно   есть.   Это   так называемый орнитиновый цикл, открытый немецкими биохимиками Кребсом и Гензелейтом   еще  в 1932 году.  Орнитиновый  цикл  –  это  метаболическая последовательность, реализующаяся в печени с помощью набора специальных ферментов (всего их пять). В результате  этого цикла  токсический аммиак превращается в безвредную мочевину.  1. NH3 + CO2 + АТФ     КАРБАМОИЛФОСФАТ + АДФ 2. ОРНИТИН + КАРБАМОИЛФОСФАТ  3. ЦИТРУЛЛИН + АСПАРАГИНОВАЯ                                     КИСЛОТА                                 КИСЛОТА 4. АРГИНИНОЯНТАРНАЯ                 КИСЛОТА 5. АРГИНИН + H2O    ОРНИТИН + МОЧЕВИНА  ЦИТРУЛЛИН + ФОСФАТ   АРГИНИНОЯНТАРНАЯ    ФУМАРОВАЯ КИСЛОТА + АРГИНИН Орнитиновый цикл В цикле Кребса задействованы такие метаболиты, как карбамоилфосфат, орнитин, цитруллин, аспарагиновая кислота, аргинин, а также необходимая для   любого   биосинтетического   процесса   аденозинтрифосфорная   кислота. Ферменты орнитинового цикла ежедневно из 16 г аммиака образуют около 30 г   мочевины.   Последняя   удаляется   через   почки.   Однако   оказывается,   что небольшая   часть  мочевины –  примерно   до  1  г  –  экскретируется  кожными покровами, что можно обнаружить следующим опытом. О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ (КАРБАМИДА) В СМЫВАХ С КОЖИ К 0,5–1,0 мл кожного смыва добавить последовательно два реактива:  а) 0,1 мл 1 %­ного спиртового раствора диметилглиоксима (С4Н8N2О2); б) 1,0 мл 0,025 %­ного раствора тиосемикарбазида (СN3H4S) в 25 %­ной серной кислоте. Проба перемешивается и ставится в кипящую водяную баню на   5–10   минут.   Развивается   красное,   точнее,   пурпурное   окрашивание, указывающее на присутствие мочевины в смыве. Для большей наглядности опыта   ставим   еще   пробу   с   водой   (окраски   нет)   и   с   1   %­ным   раствором мочевины (ярко­пурпурная окраска). Диметилглиоксим   –   достаточно   доступный   и   недорогой   реактив, используемый   в   аналитической   химии   для   определения   ионов   никеля   и некоторых других переходных металлов. Эта реакция известна как реакция Чугаева. Что касается тиосемикарбазида, то опыт можно выполнить  и безнего, добавив вместо реактива б) просто 25 %­ную серную кислоту. В этом случае   развивается   желтое   окрашивание.   И   самый   простой   вариант определения мочевины – добавить раствор диметилглиоксима прямо в 25 %­ ную серную кислоту. Однако в этом случае реактив быстро портится и его надо готовить свежим. Реакция очень чувствительна. Достаточно всего 50 мкг мочевины в пробе, чтобы   развилось   окрашивание.   С   другой   стороны,   через   кожные   покровы выделяется довольно много мочевины. Поэтому данная реакция получается, даже если на кожу просто наложить кусочек влажной фильтровальной бумаги размером 1  1 см и потом его экстрагировать в 1 мл воды (см. выше – метод аппликации).   Таким   образом   можно   сравнить   интенсивность   экскреции мочевины разными участками кожи человека. Ещё одна  к а ч е с т в е н н а я  р е а к ц и я  на мочевину и уреиды. Мочевину в смывах с кожи можно обнаружить и более простой, но менее чувствительной   реакцией   с   4­диметиламинобензальдегидом   (реактивом Эрлиха).   Этот   реактив   в   кислой   среде   образует   с   мочевиной   и   другими уреидопроизводными ярко­желтое окрашивание. Реакция получается лучше в капельном   варианте.   На   кусочек   фильтровальной   бумаги   наносим   каплю кожного смыва (лучше использовать смыв с десяти концевых фаланг пальцев, сконцентрированный   упариванием   в   10–20   раз).   Каплю   смыва   подсушить, обвести   простым   карандашом   и   смочить   1   %­ным   раствором   4­ диметиламинобензальдегида   в   этиловом   спирте   с   добавлением   нескольких капель   концентрированной   соляной   кислоты.   Наблюдаем   постепенно нарастающее   желтое   окрашивание.   Для   сравнения   рядом   можно   нанести каплю   1   %­ного   раствора   мочевины.   Этой   же   процедурой   выявляется аминокислота цитруллин, содержащаяся в корковом слое зелёного огурца или арбуза.   Когда­то   давно   мы   на   основе   этой   цветной   реакции   разработали количественный метод определения мочевины в сыворотке крови человека.  Вообще   4­диметиламинобензальдегид   (бледно­желтый   порошок   с приятным   запахом   сена)   является   весьма   полезным   реактивом   для аналитической   химии.   С   помощью   его   можно   определять   аминокислоту триптофан и другие производные индола. Именно с этой целью предложил использовать этот реактив знаменитый немецкий микробиолог Эрлих. О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРЕАТИНА И КРЕАТИНИНА НА КОЖЕ К 1 мл смыва с кожи последовательно добавляем 0,1 мл 1 %­ного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10 %­ного раствора гидроксида натрия. Проба перемешивается и ставится в кипящую водяную баню на 10 минут. Исходное бледно­желтое   окрашивание   (за   счет   пикриновой   кислоты)   переходит   в оранжевое,   что   указывает   на   присутствие   в   смыве   креатина   и   (или)   его ангидрида   креатинина.   Поскольку   эти   гуанидиновые   производныеэкскретируются   через   кожу   в   небольших   количествах,   для   получения положительного результата необходимо сделать смыв не менее чем с десяти фаланг пальцев, еще лучше полученный объем смыва упарить в фарфоровой чашке   в   2–5   раз   и   с   этим   концентратом   поставить   цветную   реакцию   с пикриновой кислотой.  Креатин   –   соединение,   мало   известное   в   широких   кругах.   Он   активно синтезируется в мышечной ткани при участии трех аминокислот: аргинина, глицина,  метионина.   Содержание   креатина   в   мышцах   находится   на   уровне 200–550 мг на 100 г мышечной ткани. Таким образом, стандартный человек носит в себе от 60 до 160 г чистого креатина. Креатин в мышечных клетках – миоцитах – взаимодействует с аденозинтрифосфатом (АТФ) с образованием креатинфосфата: Креатин + АТФ = креатинфосфат + АДФ Эту   реакцию   катализирует   специальный   фермент,   точнее   семейство ферментов (изоферменты) под названием креатинфосфокиназы. Креатинфосфат играет важную роль в мышечном сокращении. Дело в том, что связь N – P в креатинфосфате является макроэргической. А это значит, что   при   ее   гидролизе   освобождается   повышенное   количество   энергии. Последняя и используется для сокращения мышечных волокон (миофибрилл). Здесь   мы   сталкиваемся   с   интересным   фактом   превращения   химической энергии (распад N – P связи) в биомеханическую (сокращение мышцы).  Гидролиз   креатинфосфата   обеспечивает   быстрые   и   резкие   мышечные усилия, например, бокс, прыжки, толкание штанги и т. п. При длительной мышечной работе включаются другие биохимические механизмы, а именно анаэробный и аэробный гликолиз, то есть распад глюкозы, который приводит к синтезу аденозинтрифосфата. Можно ожидать, что у человека с большой мышечной массой содержание креатинфосфата   и  креатина   будет   повышено.  Не  случайно,  что  грамотныеспециалисты   по   спортивной   медицине   живо   интересуются   метаболизмом креатина и ищут пути стимуляции биосинтеза креатинфосфата. Любопытно,   что   в   организме   креатин   практически   не   подвергается дальнейшему   распаду,   он   только   теряет   молекулу   воды,   превращаясь   в циклический   ангидрид   креатинин,   последний   выделяется   почками   в количестве   1,1–2,7   г   в   сутки.   С   помощью   вышеописанного   опыта   мы показываем,   что   креатин   и   креатинин   (они   оба   дают   цветную   реакцию   с пикриновой кислотой) выделяются, правда, в небольшом количестве, и через кожу. Нетрудно догадаться, что при нарушении выделительной функции почек (хроническая   почечная   недостаточность)   будет   наблюдаться   повышение уровня креатина в крови. Ситуация здесь такая же, как в случае с мочевиной (см. опыт). Возможно также, что у таких людей будет повышена и чрезкожная экскреция   креатина,   однако   нам   до   сих   пор   не   попадались   такого   рода исследования. С целью выявления почечной недостаточности врачи исследуют реакцию организма   на   нагрузку   определенной   безвредной   дозой   креатина.   Это называется клиренс­тест креатинина. Так что добыть креатин как стандарт для   опыта   можно   у   врачей,   лечащих   почечных   больных.   Что   касается пикриновой кислоты, то это не столь дефицитный реагент, к тому же широко применяемый   в   аналитической   химии.   Ранее   её   использовали   для   окраски шерсти и шелка  в желтый цвет. Надо иметь в виду, что соли пикриновой кислоты в сухом виде взрывоопасны. П. Каррер в своем фундаментальном «Курсе органической химии» отмечает, что «многие органические основания образуют   красивые   труднорастворимые   пикраты,   поэтому   пикриновая кислота   широко   применяется  для   выделения   и  очистки   таких  оснований». Собственно, этим свойством пикриновой кислоты и можно воспользоваться в данном   опыте.   Думаем,   что   учитель   химии   должен   иметь   в   своем «химическом музее» немножко пикриновой кислоты. Описанная цветная реакция известна с 1886 года, когда ее предложил  известный немецкий химик Яффе. На основе ее Поппер и сотрудники  разработали надежный метод определения креатина в крови. Ну а мы  применим эту реакцию для анализа кожных смывов. Надо, впрочем, отметить,  что реакция Яффе недостаточно специфична, её дают, например, углеводы.