Технология рекомбинантных ДНК

ЖЕТЫСУСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. ИЛЬЯСА ЖАНСУГУРОВА                                                                                                                        РЕФЕРАТ Тема: Технология рекомбинантных ДНК                                  Выполнила: Тлеуханова М.                            ТАЛДЫКОРГАН, 2019 Введение Создаваемые генными инженерами рекомбинантные ДНК называют химерными. Они были   созданы   для   самых   разнообразных   целей,   в   том   числе   и   для   целенаправленого воздействия на ВИЧ. В последние годы число научных работ в этом направлении очень велико. Одна из испытанных схем с использованием химерных ДНК заключалась в следующем. К гену, кодирующему   белок­рецептор   CD4,   "подшили"   другой   ген,   который   обеспечивает   синтез растительного белка рицина. Рицин еще в средние века использовался в качестве сильнейшего яда. Попадая в клетку, он блокирует синтез белка в цитоплазме, тем самым убивая ее. После внесения в клетки такой рекомбинантной ДНК в конечном итоге происходит образование кодируемого   ей   химерного   белка.   Та   его   часть,   которая   соответствует   белку­рецептору, обеспечивает строго специфическое связывание химеры с клетками, на поверхности которых содержится вирусный белок CD4.  Другая же представляет собой яд рицин и уничтожает клетки, с которыми связывается химерная молекула. Таким образом, одна часть химеры обеспечивает направленный поиск в организме клеток, зараженных вирусом, а другая ее часть убивает их. Схема довольно проста и эффективна. В качестве "убийцы" можно использовать не только ген рицина, но и некоторые другие гены. Другой   подход   к   борьбе   с   ВИЧ­инфекцией   основан   на   способности   некоторых вирусных   белков   (Tat   и   Rev),   чрезвычайно   важных   для   размножения   ВИЧ   в   клетках, специфически связываться с определенными участками молекулы вирусной РНК. Для того, чтобы   предотвратить   этот   жизненно   важный   процесс,   было   предложено   вводить   в инфицированные клетки искусственно синтезированные РНК, содержащие участки связывания с вирусными белками. Вирусному белку все равно, с чем связываться ­ с вирусной РНК или точно такой же "копией", сконструированной искусствено. Добавленная в клетку в большом количестве, "копия" играет в данном случае роль "ловушки": если ее много, белок вируса будет связываться преимущественно с ней, а не с РНК вируса, и, в результате этого, ВИЧ перестанет размножаться. Теоретически   описанные   подходы   выглядят   очень  привлекательно.  И,   как   показали проведенные испытания, в изолированных клетках они работают очень хорошо. Однако нет надежных   способов   доставки   и   обеспечения   долгого   функционирования   химерных "конструктов" в целом организме. Указанные трудности ученые пытаются преодолеть с помощью тех же вирусов. Недавно опубликовано   сообщение   об   успешном   использовании   для   противодействия   ВИЧ   вируса бешенства. Естественно, это был не вирус сам по себе, а его вариант, который не способен приводить к заболеванию. К такому варианту был "пришит" ген белка CD4. В остальном схема была та же, что и в случае с рицином. Связываясь только с ВИЧ­инфицированными клетками, рекомбинантный вирус их уничтожал, другие же клетки оставались неизменными. Возможно, такой путь окажется эффективным в будущем. Недавно появилось сообщение о создание еще одной "химеры" против ВИЧ на основе антиретровирусного препарата энфервиртид. Энфервиртид   представляет   собой   короткий   фрагмент   белка   gp41   ВИЧ   ,   который, несмотря на то, что он вроде как "родной", препятствует вирусу "сливаться" с клеткой. На основе ретровируса мышей сконструировали химерный вирус, который способен в клетках человека   производить   такой   короткий   фрагмент   белка   ВИЧ   и   "выставлять"   его   на поверхности клеток, зараженных химерным вирусом. В результате ВИЧ не может проникать в клетки даже при наличии в них всех рецепторов и корецепторов. Таким образом, фрагмент вирусного белка выступает в качестве "щита" против целого вируса. Очень важно, что защита срабатывает на самом начальном этапе инфицирования клетки. Ведь когда вирус уже проник в нее, с ним бороться практически невозможно. Начатые в клинике испытания новой "химеры", по утверждению исследователей, дали очень обнадеживающие результаты. дезоксирибонуклеиновый ген секвенирование 1. Конструирование рекомбинантных ДНК       Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух   или   более   фрагментов   ДНК,   выделенных   из   различных   биологических   источников. Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает   на   сущность   генетической   инженерии   и   ее   отличие   от   всех   остальных   методов получения   гибридных   (или   химерных)   организмов,   таких   как   генетическая   селекция, эмбриональная инженерия и т.д. Фрагменты   ДНК,   в   том   числе   и   фрагменты,   содержащие   гены,   получают   с использованием   ферментов   рестриктаз.   Рестриктазы   могут   образовывать   фрагменты   как   с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод) Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная   ДНК   была   получена   С.   Коэном   с   сотрудниками   в   1973   году.   Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания   оснований,   и   поэтому   их   называют   комплементарными   или   липкими   концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ­концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ­концами, образуемыми   Hind   III.   Но   любые   два   фрагмента   (независимо   от   их   происхождения), образовавшиеся   под   действием   одной   и   той   же   рестриктазы,   могут   слипаться   за   счет образования   водородных   связей   между   однонитевыми   участками   комплементарных нуклеотидов (рис. 39). Однако   после   такого   спаривания   полной   целостности   двойной   спирали   не восстановится,   поскольку   останется   два   разрыва   в   фосфодиэфирном   остове.   Для   его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК­лигазу. Этот   фермент   в   живой   клетке   выполняет   ту   же   функцию   ­   сшивание   фрагментов   ДНК, синтезирующихся при репликации. Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод) Липкие   концы   не   абсолютно   необходимы   для   связывания   фрагментов   ДНК.   Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК­лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.   Впервые   такие   эксперименты   были   выполнены   в   1972   году   Полем   Бергом   в Стенфордском   университете,   США.   Липкие   концы   также   можно   ферментативным   путем присоединить   к   молекулам   ДНК   с   тупыми   концами.   Для   этого   используют   фермент   ­ концевую  трансферазу  из  тимуса  теленка,  которая  присоединяет  нуклеотиды  к 3  ­концам цепей   ДНК.   Если   к   3'­концам   одного   из   рекомбинируемых   in   vitro   фрагментов   ДНК   с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)­ сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента ­ олиго (dT)­сегменты примерно такой   же   длины,   то   при   смешении   полученных   таким   образом   фрагментов   происходит спаривание   за   счет   образования   водородных   связей   между   олиго   (dА)­   и   олигo   (dT) ­последовательностями   (рис.   40).   Для   ковалентного   соединения   двух   фрагментов используется   ДНК­лигаза.   Эти   процедуры   составляют   основу   для   второго   общего   метода получения рекомбинантных молекул ДНК. Поскольку   можно   формировать   достаточно   длинные   взаимокомплементарные одноцепочечные   концы,   гибридные   молекулы   образуются   с   высокой   эффективностью.   В частности,   поэтому   при   клонировании   ДНК­копий   матричных   РНК,   которые   доступны   в ограниченных   количествах,   обычно   ис¬пользуют   коннекторный   метод.   При   таком   способе соединения   между   фрагментами   встраиваются   участки   ААААА.   Такие   дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами В   ситуации,   когда   необходимо   сшить   фрагменты,   образованные   разными эндонуклеазами   рестрикции,   и   имеющие   разные,   то   есть   некомплементарные   друг   другу липкие   концы,   применяют   так   называемые   линкеры   (или   "переходники").   Линкеры   ­   это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году. Существуют   большие   наборы   таких   генных   "переходников".   Естественно,   что   при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой­либо регуляторный генетический   элемент,   например,   промотор   или   участок,   связанный   с   рибосомой.   В   этом случае   линкеры   обеспечивают   не   только   объединение   генов,   но   и   обуславливают   их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец ­ липкий конец". При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением   липких   концов   с   помощью   фермента   ­   эндонуклеазы   S1,   которая   разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК­ полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить. 2. Особенности организации генов про­ и эукариот Геном современных прокариотических клеток характеризуется относительно небольшими размерами. У кишечной палочки он представлен кольцевой молекулой ДНК длиной около 1 мм, которая содержит 4∙106 пар нуклеотидов, образующих около 4000 генов. Основная масса ДНК прокариот (около 95%) активно транскрибируется в каждый данный момент времени. Как  было   сказано  выше,   геном   прокариотической   клетки   организован   в   виде   нуклеоида   ­ комплекса ДНК с негистоновыми белками. У   эукариот   объем   наследственного   материала   значительно   больше.   У   дрожжей   он составляет 2,3 107 п.н., у человека общая длина ДНК в диплоидном хромосомном наборе клеток ­ около 174 см. Его геном содержит 3∙109 п.н. и включает по последним данным 30­40 тыс. генов. У некоторых амфибий и растений геном характеризуется еще большими размерами, достигающими   1010   и   1011   п.   н.   В   отличие   от   прокариот   в   эукариотических   клетках одновременно   активно   транскрибируется   от   1   до   10%   ДНК.   Состав   транскрибируемых последовательностей   и   их   количество   зависят   от   типа   клетки   и   стадии   онтогенеза. Значительная   часть   нуклеотидных   последовательностей   у   эукариот   не   транскрибируется вообще ­ молчащая ДНК. Большой объем наследственного материала эукариот объясняется существованием в нем помимо уникальных также умеренно и высоко повторяющихся последовательностей. Так, около  10% генома  мыши  составляют  тандемно  расположенные  (друг за  другом) короткие нуклеотидные   последовательности,   повторенные   до   106   раз.   Эти   высоко   повторяющиеся последовательности   ДНК   располагаются   в   основном   в   гетерохроматине,   окружающем центромерные   участки.   Они   не   транскрибируются.   Около   20%   генома   мыши   образовано умеренными повторами, встречающимися с частотой 103­105 раз.  Такие   повторы   распределены   по   всему   геному   и   транскрибируются   в   РНК.   К  ним относятся   гены,   контролирующие   синтез   гистонов,   тРНК,   рРНК   и   некоторые   другие. Остальные   70%   генома   мыши   представлены   уникальными   нуклеотидными последовательностями. У растений и амфибий на долю умеренно и высоко повторяющихся последовательностей приходится до 60% генома. Избыточность   генома   эукариот   объясняется   также   экзон­интронной   организацией большинства   эукариотических   генов,   при   которой   значительная   часть   транскрибированной РНК   удаляется   в   ходе   следующего   за   синтезом   процессинга   и   не   используется   для кодирования аминокислотных последовательностей белков. В   настоящее   время   окончательно   не   выяснены   функции   молчащей   ДНК,   которая составляет значительную часть генома, реплицируется, но не транскрибируется. Высказывают предположения   об   определенном   значении   такой   ДНК   в   обеспечении   структурной   Некоторая   часть   нетранскрибируемых   нуклеотидных организации   хроматина. последовательностей, очевидно, участвует в регуляции экспрессии генов. Характеризуя   наследственный   материал   прокариотической   клетки   в   целом, необходимо   отметить,   что   он   заключен   не   только   в   нуклеоиде,   но   также   присутствует   в цитоплазме в виде небольших кольцевых фрагментов ДНК ­ плазмид. В прокариотических (бактериальных)   клетках   обнаружены   плазмиды,   которые   несут   наследственный   материал, определяющий   такие   свойства,   как   способность   бактерий   к   конъюгации,   а   также   их устойчивость к некоторым лекарственным веществам. В   эукариотических   клетках   внехромосомная   ДНК   представлена   генетическим аппаратом органелл ­ митохондрий и пластид, а также нуклеотидными последовательностями, не   являющимися   жизненно   необходимыми   для   клетки   (вирусоподобными   частицами). Наследственный   материал   органелл   находится   в   их   матриксе   в   виде   нескольких   копий кольцевых молекул ДНК, не связанных с гистонами. В митохондриях, например содержится от 2 до 10 копий мтДНК. Внехромосомная ДНК составляет лишь небольшую часть наследственного материала эукариотической   клетки.   Например,   мтДНК   человека   содержит   16569   п.н.   и   на   её   долю приходится менее 1% всей клеточной ДНК. В   отличие   от   хромосомной   ДНК,   мтДНК   характеризуется   высокой   «плотностью генов». В них нет интронов, а межгенные промежутки невелики. В кольцевой мтДНК человека содержится   13   генов,   кодирующих   белки   (3   субъединицы   цитохром   С­оксидазы,   6 компонентов   АТФазы   и   др.)   и   22   гена   тРНК.   Значительная   часть   белков   митохондрий   и пластид синтезируется в цитоплазме под контролем геномной ДНК. Если большинство ядерных генов представлены в клетках организма в двойной дозе (аллельные   гены),   то   митохондриальные   гены   представлены   многими   тысячами   копий   па клетку. Для   генома   митохондрий   характерны   межиндивидуальные   различия,   но   в   клетках одного   индивида,   как   правило,   мтДНК   идентична.   Совокупность   генов,   расположенных   в цитоплазматических   молекулах   ДНК,   называют   плазмоном.   Он   определяет   особый   тип наследования признаков ­ цитоплазматическое наследование. Общие   принципы   организации   наследственного   материала,   представленного нуклеиновыми   кислотами,   а   также   принципы   записи   генетической   информации   у   про­   и эукариот свидетельствуют в пользу единства их происхождения от общего предка, у которого уже была решена проблема самовоспроизведения и записи информации на основе репликации ДНК и универсальности генетического кода. Однако геном такого предка сохранял большие эволюционные   возможности,   связанные   с   развитием   надмолекулярной   организации наследственного   материала,   разных   путей   реализации   наследственной   информации   и регуляции этих процессов. Многочисленные   указания   на   различия   в   организации   генома,   деталях   процессов экспрессии генов и механизмов ее регуляции у про­ и эукариот свидетельствуют в пользу эволюции названных типов клеток по разным направлениям после их дивергенции от общего предка. Существует  предположение,   что  в  процессе  возникновения  жизни  на  Земле  первым шагом   явилось   образование   самовоспроизводящихся   молекул   нуклеиновых   кислот,   не несущих первоначально функции кодирования аминокислот в белках. Благодаря способности к   самовоспроизведению   эти   молекулы   сохранялись   во   времени.   Таким   образом, первоначальный отбор шел на способность к самосохранению через самовоспроизведение. В соответствии с рассмотренным предположением позднее некоторые участки ДНК приобрели функцию   кодирования,   т.е.   стали   структурными   генами,   совокупность   которых   на определенном этапе эволюции составила первичный генотип.  Экспрессия   возникших   кодирующих   последовательностей   ДНК   привела   к формированию   первичного   фенотипа,   который   оценивался   естественным   отбором   на способность выживать в конкретной среде. Важным моментом в рассматриваемой гипотезе является предположение о том, что существенным   компонентом   первых   клеточных   геномов   была   избыточная   ДНК,   способная реплицироваться,   но   не   несущая   функциональной   нагрузки   в   отношении   формирования фенотипа. Предполагают, что разные направления эволюции геномов про­ и эукариот связаны с   различной   судьбой   этой   избыточной   ДНК   предкового   генома,   который   должен   был характеризоваться   достаточно   большим   объемом.   Вероятно,   на   ранних   стадиях   эволюции простейших   клеточных   форм   у   них   еще   не   были   в   совершенстве   отработаны   главные механизмы потока информации (репликация, транскрипция, трансляция). Избыточность ДНК в   этих   условиях   создавала   возможность   расширения   объема   кодирующих   нуклеотидных последовательностей за счет некодирующих, обеспечивая возникновение  многих  вариантов решения проблемы формирования жизнеспособного фенотипа. 3. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК            Описанные методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели   большое   значение   сами   по   себе.   Но   они   также   проложили   путь   к   разработке исключительно   эффективных   методов   секвенирования   ДНК   и   создания   рекомбинантных молекул.   Секвенирование   позволяет   довольно   быстро   определить   полную   нуклеотидную последовательность   сегмента   длиной   100   ­   500   нуклеотидных   пар,   образующегося   при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Метод Маскама и Гилберта (химический) Один из методов основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной   вводят   флюоресцирующую   метку.   Ее   можно   «цеплять»   и   к   нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску. Препарат меченой ДНК делят   на   четыре   порции   и   каждую   из   них   обрабатывают   реагентом,   специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Разрушение   идет   в   2   этапа.   На   первом   этапе   происходит   модификация   азотистого основания  и   последующее   выщепление  его.  На  втором  этапе  производят  гидролиз  ДНК  в местах выщепления оснований. Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом. Адениновые остатки метилируются по третьему атому азота, гуаниновые ­ по положению N7. Если такую модификацию обработать 0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин. При последующей инкубации в щелочной среде (0,1 М NaOH) при температуре +90оС происходит разрушение   сахаро­фосфатной   связи   в   местах   выщепления   оснований.   Обработка поврежденных молекул пиперидином приводит к гидролизу ДНК по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые   основания   модифицируются   гидразином.   В   бессолевой   среде модифицируется   и   цитозин,   и   тимин,   в   присутствии   2   М   NaCl   модифицируется   только цитозин. При дальнейшей обработке пиперидином происходит расщепление ДНК по точкам модификации. Можно использовать и другие реакции химической модификации оснований и расщепления   по   ним   молекул   ДНК.   В   результате   получается   набор   меченых   фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную   метку,   оставляют   "отпечатки"   на   рентгеновской   пленке.   По   положению отпечатков   можно   определить,   на   каком   расстоянии   от   меченого   конца   находилось разрушенное   основание,   а   зная   это   основание   ­   его   положение.   Так   набор   полос   на рентгеновской   пленке   определяет   нуклеотидную   последовательность   ДНК.   Аналогично наблюдают  флюоресцентное окрашивание.  Если  для  каждого  из   четырех  нуклеотидов  был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать. Метод Сэнгера (ферментативный) Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК­полимеразу I. В клетке этот фермент участвует   в   процессе   репликации,   заполняя   пробелы   между   вновь   синтезированными фрагментами   ДНК   (фрагментами   Оказаки).   Для   работы   фермента   в   пробирке   требуются предшественники ДНК ­ дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок ­ затравка, с которого   Были   также   синтезированы   модифицированные начинается   синтез   (рис. дидезоксирибонуклеотиды,   в   которых   дезоксирибоза   3’­ОН   отсутствует,   для   каждого   из   41). четырех оснований ДНК. ДНК­полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации. Реакционная   смесь   по   Сэнгеру   состоит   из   цепи   ДНК,   нуклеотидную последовательность   которой   надо   определить,   короткого   фрагмента   "меченой"   ДНК, комплементарной   концевому   отрезку   этой   цепи   (затравка),   одного   из   четырех   ddNTP   и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые   фрагменты   ДНК   разделяют   в   полиакриламидном   геле   (с   точностью   до   одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 41). В   настоящее   время   определение   точной   нуклеотидной   последовательности   любого сегмента   ДНК   умеренной   длины   ­   вполне   разрешимая   задача.   Уже   определена последовательность нескольких сотен генов про­ и эукариот. Зная последовательность гена и генетический   код,   легко   определить   аминокислотную   последовательность   кодируемого   им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру   белка   через   нуклеотидную   последовательность,   чем   с   помощью   прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации   ДНК.   В   1996   году   был   секвенирован   геном   дрожжей,   в   1998   г.   ­   геном арабидопсиса, в 2000 году ­ геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача. Сразу   вслед   за   разработкой   быстрых   методов   секвенирования   появились   столь   же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее   заданной   последовательностью.   Теперь   за   три­четыре   дня   можно   синтезировать последовательность   из   12   ­   20   нуклеотидов.   Автоматизация   этой   процедуры   еще   более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы ­ ДНК­синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов. Гибридизация   как   высокочувствительный   метод   выявления   специфических последовательностей нуклеотидов Если   водный   раствор   ДНК   нагреть   до   100оС   и   повысить   рН   до   13,   то   ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при   температуре   65оС   вело   к   восстановлению   структуры   двойной   спирали.   Этот   процесс называется   ренатурация   или   гибридизация.   Процессы   гибридизации   происходят   между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК ­ ДНК, РНК ­ РНК, ДНК ­ РНК. Для   теста   необходимо   иметь   чистый   одноцепочечный   фрагмент   ДНК, комплементарный   той   последовательности,   которую   хотим   обнаружить.   Этот   фрагмент получают   либо   клонированием,   либо   путем   химического   синтеза.   Одноцепочечная   ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК­зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. ДНК­зонды   применяются   в   различных   целях.   Гибридизация   ДНК­зонда   с   РНК, выделенной   из   анализируемой   клетки,   может   выявить   наличие   или   отсутствие   экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК­зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней. В большинстве случаев мутации, ведущие к наследственным болезням, рецессивны, то есть   болезнь   развивается,   если   человек   получает   дефектные   гены   от   обоих   родителей. Аномальные эмбрионы лучше выявлять до рождения. Например, для серповидноклеточной анемии   в   мутантном   гене,   кодирующем   бэта­цепь   гемоглобина,   последовательность   ГАГ заменена на ГТГ. В этом случае синтезируют олигонуклеотид длиной около 20 оснований, метят   радиоактивной   меткой.   Из   эмбриональных   клеток,   содержащихся   в   амниотической жидкости, выделяют ДНК и используют ее для гибридизации. Если эмбрион дефектен, то тест будет положительным. Анализ   проводят   по   следующей   схеме   (рис.   42):   исследуемую   ДНК   гидролизуют рестриктазами,   фракционируют   электрофорезом,   переносят   разделенные   фрагменты   на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. В отечественной литературе его принято называть «южный блоттинг». «Блоттинг» ­ в переводе с английского означает «промокашка», «саузерн»   ­   «южный»,   в   данном   случае   игра   слов:   фамилия   ученого   переводится   как географическое направление. Молекулы   ДНК   разгоняют   в   агарозном   геле   электрофорезом.   ДНК   в   геле денатурируют   щелочью.   Щелочь   нейтрализуют   и   пластину   геля   покрывают   листом нитроцеллюлозы.   Сверху   на   нитроцеллюлозу   помещают   стопку   листов   фильтровальной бумаги,   обеспечивая   медленный   ток   буферного   раствора   через   гель   в   направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным   фильтром.   После   прогревания   фильтра   при   80оС   в   вакууме   ДНК необратимо   связывается   с   нитроцеллюлозой.   Расположение   полос   иммобилизованной   ДНК точно соответствует их расположению в геле. ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой   ДНК.   Блоттинг   по   Саузерну   является   исключительно   полезным   также   и   для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д. Аналогичным   методом   на   нитроцеллюлозу   переносят   молекулы   РНК   (Северный блоттинг) и белка (Западный блоттинг). Из частей света осталась свободной только западная, хотя вакантными остались 2 класса макромолекул ­ углеводы и липиды. Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК­зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах.   Если   в   исследуемом   образце   есть   последовательности,   комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. Такие   ДНК­чипы   можно   применять   для   комплексной   диагностики   инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы,   очень   надежны,   просты   в   обращении   и   могут   многократно   использоваться. Недостаток ­ дорогая аппаратура для детекции.  4. Методы клонирования ДНК       После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить. Существует   два   подхода   к   клонированию   ДНК.   Первый   подход   предполагает использование   бактериальных   или   дрожжевых   клеток   для   размножения   введенной   в   них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro. Клонирование ДНК in vivo Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК). Геномная   библиотека.   Если   геном   какого­либо   организма   разрезать,   вставить   в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома. Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК.   Клеточную   ДНК   обрабатывают   той   же   рестриктазой,   добавляют   к   плазмидной, добавляют   лигазы.   Таким   образом   получают   рекомбинантную   плазмидную   ДНК,   которую вводят   в   бактериальные   или   дрожжевые   клетки.   Плазмида   реплицируется   с   образованием многих   копий.   Многие   плазмиды   несут   ген   устойчивости   к   антибиотикам,   и   если   в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком. Каждая   такая   колония   представляет   собой   клон   или   потомство   одной   клетки. Плазмиды   одной   колонии   содержат   клон   геномной   ДНК,   а   совокупность   плазмид   можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности. Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной   транскриптазы   комплементарной   нити   ДНК.   Затем   создают   щелочные   условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК­полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК   встраивают   в   плазмиды   и   вводят   в   клетки   бактерий.   При   амплификации   плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК). Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед   превращением   ее   в   матричную,   после   чего   следует   сплайсинг   (сращивание). Бактериальные   клетки   не   могут  осуществлять   такую  модификацию   РНК,   образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК. Методы клонирования ДНК Полимеразная цепная реакция В   1985   году   К.   Мюллис   с   сотрудниками   разработали   метод   клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К   анализируемому   образцу   ДНК   добавляют   в   избытке   2   синтетических олигонуклеотида ­ праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3’­концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают для разделения цепей двойной спирали, а   при   охлаждении   происходит   гибридизация   праймеров   с   комплементарными   участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками ­ затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК­ полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл, рис. 43). Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В   процессе   охлаждения   праймеры,   находящиеся   в   избытке,   вновь   эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение   в   систему   ДНК­полимеразы   инициирует   второй   цикл   полимеразной   реакции. Многократное   повторение   описанной   процедуры   позволяет   провести   30   и   более   циклов ферментативного   удлинения   праймеров.   При   этом   число   сегментов   ДНК,   ограниченных   с обоих   концов   используемыми   праймерами,   с   каждым   циклом   ПЦР   увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n ­ число циклов). Выход всех других продуктов   реакции   увеличивается   по   линейной   зависимости   (рис.   44).   Таким   образом,   в процессе   рассматриваемой   реакции   эффективно   амплифицируется   только   та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами. Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК­полимеразы I E. coli. Однако   недостатком   данного   подхода   являлось   то,   что   после   каждого   цикла   реакции необходимо   было   вносить   в   реакционную   смесь   новую   порцию   фермента.   Кроме   того,   в оптимальных   температурных   условиях   такой   полимеразной   реакции   (37   °С)   появлялись вторичные участки связывания праймеров и наблюдалась амплификация незапланированных сегментов   генома,   т.   е.   специфичность   амплификации   не   была   полной.   Существенное улучшение метода полимеразной цепной реакции было достигнуто после замены фрагмента Кленова   на   ДНК­полимеразу   термофильной   бактерии   Thermus   aquaticus   (Taq­полимераза). Температурный оптимум реакции, направляемой Taq­полимеразой, находится в районе 70 °С. Другим   важным   свойством   является   то,   что   данная   полимераза   не   инактивируется   после длительной инкубации при 95 °С. Используя   Taq­полимеразу,   удалось   решить   сразу   две   проблемы.   Во­первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости   после   каждого   цикла   реакции   добавлять   новую   порцию   фермента.   Такое упрощение   процедуры   позволило   автоматизировать   проведение   ПЦР,   так   как   теперь требовалось   лишь   перенесение   образца   с   определенным   интервалом   времени   в   разные температурные   условия:   90­95   °С   (температура   денатурации)   и   60­70   °С   (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во­вторых, высокий температурный оптимум реакции,   катализируемой   Taq­полимеразой,   позволяет   подбирать   жесткие   температурные условия   отжига,   обеспечивающие   гибридизацию   праймеров   только   в   заданном   районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода. Используя   метод   ПЦР,   можно   in   vitro   селективно   обогащать   препарат   ДНК фрагментом   с   определенной   последовательностью   в   миллион   и   более   раз.   Это   позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды  в образце  из  105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется  в виде дискретной   полосы   после   электрофоретического   разделения   молекул   ДНК   и   окраски   их этидиум   бромидом.   Если   к   праймеру   пришить   фермент,   то   ферментная   метка   будет накапливаться   при   амплифицировании.   Продукт   амплификации   проверяется   по   принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать   стрептавидин   (см.   главу   3).   Его   можно   пришивать   как   к   праймеру,   так   и   к нуклеотидам.   В   последнем   случае   нуклеотиды,   меченные   стрептавидином,   добавляются   к обычным,   идущим   на  синтез  комплементарной  цепи   ДНК.  Этим  достигается  еще  большее усиление сигнала. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования.   Поскольку   при   этом   не   требуется   промежуточный   этап   клонирования фрагмента   ДНК   в   молекулярных   векторах,   ПЦР   иногда   называют   бесклеточным молекулярным   клонированием   (cell­free   molecular   cloning).   Автоматизированная   процедура Taq­полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3­4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного . Контроль над исследованиями рекомбинантных ДНК Споры о роли генетики начались задолго до современного расцвета генной инженерии. Еще в 1970­х годах не только ученое сообщество, но и широкая публика принялись обсуждать вопросы, связанные с противоречивыми перспективами новых биологических технологий. В чем же заключался основной вопрос? Основной темой споров была рекомбинантная ДНК, которую   называли   также   химерной   ДНК.   В   лабораторных   условиях   стало   возможным создавать искусственные ДНК, комбинируя между собой гены разных видов и получая такие сочетания, которые бы никогда не встретились в природе. Большинство искусственных ДНК синтезируются   в   научных   целях.   Это   контролируемые   эксперименты,   на   основе   которых ученые   стремятся   получить   новые   сведения   об   изучаемых   ими   биологических   системах. Однако   в   некоторых   случаях   исследователям   просто   любопытно   «посмотреть,   что получится».   Часто   получаются   ожидаемые   результаты,   но   порой   происходит   нечто неожиданное. И это вполне объяснимо с научной точки зрения: ведь мы никогда не можем заранее   все   знать   и   все   предсказать.   Поэтому   ученые   никогда   не   могут   обещать,   что полученные   ими   клетки   с   рекомбинантными   ДНК   будут   абсолютно   безопасными.   Именно такая неуверенность и послужила отправной точкой для дискуссий по поводу опасностей современной генетики. С такой проблемой столкнулись молекулярные биологи, изучавшие в 1970­х годах гены вирусов, вызывающих возникновение рака, и внедрявшие их в бактерии Е. coli. При этом они руководствовались   благими   намерениями:   изучить   функции   раковых   генов   на   примере простых биологических систем. Но с помощью данной технологии можно было бы создать и вредные канцерогенные бактерии, заражающие людей. По мере развития технологии ученые все более приходили к мысли об опасном направлении своей работы и задумывались о ее глобальных   последствиях.   В   конце   концов,   11   известных   молекулярных   биологов опубликовали открытое письмо в престижных журналах «Nature» и «Science», призвав своих коллег наложить мораторий на определенные виды экспериментов и с большей осторожностью относиться к остальным опытам. В частности, они предлагали ввести запрет на эксперименты с генами устойчивости к антибиотикам, генами токсинов и генами канцерогенных вирусов; призывали организовать дискуссию на эту тему; просили Национальный институт здоровья США (NIH) разработать правила и принципы проведения подобных экспериментов. Для ученого сообщества это был шаг огромной важности: перед лицом неизвестной и в общем­то не вполне определенной опасности ученые осознанно воздерживались от проведения экспериментов. Подписавшиеся под этим письмом, по всей видимости, не ожидали, какой резонанс вызовет их заявление во всем мире. Заключение        Генетическая инженерия, а в частности работа с рекомбинантными ДНК на сегодняшний день является важнейшей и наиболее быстро развивающейся составной частью биотехнологии. Методы   генной   инженерии   преобразуют   клетки   бактерий,   дрожжей   и   млекопитающих   в "фабрики"   для   масштабного   производства   любого   белка.   Это   дает   возможность   детально анализировать   структуру   и   функции   белков   и   использовать   их   в   качестве   лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli)  стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы   животных,   поэтому   стоимость   его   была   очень   высока.   Для   получения   100   г кристаллического   инсулина   требуется   800­1000   кг   поджелудочной   железы,   а   одна   железа коровы весит 200 ­ 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга   диабетиков.   В   1978   году   исследователи   из   компании   "Генентек"   впервые   получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки.  Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано,   что   он   не   содержит   белков   E.   coli,   эндотоксинов   и   других   примесей,   не   дает побочных   эффектов,   как   инсулин   животных,   а   по   биологической   активности   от   него   не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице   РНК   с   помощью   обратной   транскриптазы   синтезировали   ее   ДНК­копию.   После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы   экстракции   и   выделения   гормона   были   сведены   к   минимуму.   Из   1000   литров культуральной   жидкости   можно   получать   до   200   граммов   гормона,   что   эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы. Соматотропин ­ гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 ­ 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и   мог   содержать   медленно   развивающиеся   вирусы.   Компания   "Genentec"   в   1980   году разработала   технологию   производства   соматотропина   с   помощью   бактерий,   который   был лишен   перечисленных   недостатков.   В   1982   году   гормон   роста   человека   был   получен   в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины. Если   гибридную  ДНК  ввести   в  оплодотворенное   яйцеклетку,  могут   быть  получены трансгенные   организмы,   экспрессирующие   мутантный   ген   и   передающие   его   потомками. Генетическая   трансформация   животных   позволяет   установить   роль   отдельных   генов   и   их белковых   продуктов   как   в   регуляции   активности   других   генов,   так   и   при   различных патологических  процессах.  С помощью генетической  инженерии  созданы  линии  животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками.   содержавшей   ген соматотропина   быка   в   зиготу   кролика   позволила   получить   трансгенное   животное   с   микроинъекция   рекомбинантной   ДНК,   Например, гиперпродукцией   этого   гормона.   Полученные   животные   обладали   ярко   выраженной акромегалией. Список литературы 1. Баурин В.В., Мирошниченко О.И., Захарченко В.И. и др. // Генноинженерные  сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 154­165. . Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. и др. // Генноинженерные  сельскохозяйственные животные, Москва, 1995, с. 138­153. . Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л.К. // С.­х. биология, 1993, № 6, с. 3­27. . Брем Г., Кройслих Х., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М.:  РАСХН, 1995, 326 с. . Васильев И.М., Шихов И.Я., Некрасов А.А. и др. // Доклады АН СССР, 1989, № 1, с. 206­209. . Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. и др. // Доклады РАСХН, 1992, № 9­10, с.  25­30.