Исследовательская работа. "ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC PUNCTIFORME"

МБОУ ДО «Эколого­биологический центр «Лидер­Эко» МБОУ «Лицей № 62» ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ  ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC PUNCTIFORME Выполнил: Корунас Владислав обучающийся 11 А класса МБОУ «Лицея № 62» Руководитель: Багаева Е.А., МБОУ «Лицей №62» Вяткина К.А., МБОУ ДО «Эколого­биологический центр «Лидер­Эко» к.б.н. Фазлутдинова А.И., БГПУ им. М. Акмуллы, тьютор Уфа, 2018 2 Содержание Аннотация Введение Глава I. Экология и географическое распространение вида Nostoc  punctiforme 1.1. Общая характеристика отдела Cyanobacteria 1.2. Анатомическое и морфологическое строение вида 1.3. Способы питания и экология 1.4. Географическое распространение  1.5. Значение цианобактерий Глава II. Материалы и методы исследований 2.1. Материалы исследований 2.1.1. Объект исследования 2.2. Методика исследования 2.2.1. Оборудование 2.2.2. Проведение эксперимента Глава III. Результаты собственных исследований Выводы Литература Приложение       3 4 6 7 9 9 10 10 12 12 12 12 13 13 17 23 24 25 3 Аннотация: На сегодняшний день объем используемых в  агропромышленности биологических средств защиты ничтожно мал  относительно общих объемов используемых биопестицидов, хотя их  использование может быть более предпочтительным, т.к. их эффект может  быть более предсказуемым, ввиду того, что они оказывают влияние лишь на  определенный группы живых организмов; они более предпочтительны с  маркетинговой точки зрения на фоне отрицательного образа химичесских  веществ; суспензии биопрепаратов могут играть и роль удобрений, т.к.  культивирование происходит в питательных средах.  Кроме того, сейчас в городах уменьшается площадь зеленых насаждений,  соответственно падает и их потенциал как организмов­производителей  кислорода, из­за чего растет роль других фотосинтетиков в поддержании  экологических условий городов. Для определения потенциала определенных цианобактерий как средства  защиты от грибковых заражений мы прибегли к экспериментам,  заключающимся в непосредственном посеве цианобактерий в зараженную  спорами грибов среду, поливе питательным раствором с цианобактериями  образцов мицелия плесневых грибов. Работа представлена на 24 страницах в объеме 4014 слов. В работе представлены 5 таблиц, 20 рисунков. При написании работы использовались данные 15 источников. Их перечень  представлен на странице 24 работы. Ключевые слова: цианобактерии, фунгицидная активность, бактерии,  плесневые грибы. 4 Введение Актуальность.  Биопестициды,   полученные   на   основе   фунгицидной активности   цианобактерий   являются   экологически   чистым   продуктом,   так как   их   действие   направлено   исключительно   на   определенную   группу вредителей   и   не   оказывает   влияние   на   другие   группы   живых   организмов. Поэтому необходимо разрабатывать именно такую группу борьбы с болезнями растений, которая была бы безопасной, чем химические пестициды. Цель работы: оценить возможность разработки биопестицидов на основе фунгицидной активности цианобактерии Nostoc punctiforme. Для   достижения   цели   и   доказательства   гипотезы   были   поставлены следующие задачи:  • Изучить литературу по теме исследования. • Оценить влияние цианобактерии Nostoc punctiforme на рост и развитие патогенных микроскопических грибов. • Экспериментально доказать гипотезу исследования. Объект  исследования:  грибы  (рода  Mucor,   Penicillium,   Sclerotinia, Aspergillus, Alternaria, Colletotrichum, Fusarium). Предмет исследования: вытяжка цианобактерии Nostoc punctiforme. Гипотеза исследования:  выбранный нами вид цианобактерии наиболее эффективен для использования в качестве биопестицидов. Методы исследования:  Экспериментальные методы;  Описательные методы;  Сравнительные методы. Новизна   и   научная   значимость   исследования  в   том,  что   развивается новый   метод   защиты   сельскохозяйственных   культур,   основанный   на применении биологических средств защиты растений, или биопестицидов – 5 микробиологических препаратов на основе микроорганизмов  и продуктов их жизнедеятельности. Практическая   значимость  определяется   тем,   что   полученные   в результате   исследования   данные   по   изучению   фунгицидной   активности цианобактерии  Nostoc  punctiforme  можно   использовать   для   получения биопестицидов из цианобактерий. Исследование  выполнено   на   базе  городского   технопарка   «Город будущего»   кластера   «Экобиотех»   и   Центра   развития   компетенций «Биотехнология   водорослей»   кафедры   биоэкологии   и   биологического образования   Башкирского   государственного   педагогического   университета имени Мифтахетдина Акмуллы. Структура   работы.  Работа   изложена   на   26   страницах,   включает введение,   3   главы,   выводы,   список   литературы   и   приложение.   В   работе содержатся 5 таблиц, 20 рисунков. 6 Глава I. Экология и географическое распространение вида Nostoc punctiforme  Существование цианобактерии в почве столь же обычно, как обитание их в  водоемах. На  поверхности  почвы  нередко  можно видеть  невооруженным взглядом различные разрастания – кожистые или войлокообразные пленки или слизистые   слоевища   цианобактерий.   Часто   наблюдается   также   общее позеленение   почвы,   обусловленное   массовым   развитием   микроскопических форм,   рассеянных   среди   почвенных   частиц.   Цианобактерии,   населяющие толщу почвы, можно обнаружить только под микроскопом. Особенно хорошо заметны   водоросли   при   просмотре   пробы   или   почвенной   суспензии   в люминесцентном   микроскопе,   где   хлорофиллоносные   клетки   выделяются красным свечением. Жизнеспособные цианобактерии находят на глубине до 2 м в целинных почвах и до 2,7 м в пахотных [5]. Почвенные цианобактерии отличаются изменчивостью способа питания. На небольших глубинах, в пределах проникновения света, они, как и высшие растения,   являются   типичными   фототрофами,   используя   для   фотосинтеза свет слабой интенсивности (0,04—0,1% от полного света). Поэтому основную массу   цианобактерий,   как   правило,   обнаруживают   в   самых   верхних   слоях почвы: при достаточной влажности в слое от 0 до 1 и даже до 0,2 см. С глубиной   как   численность,   так   и   видовое   разнообразие   водорослей   резко падает. В целинных почвах, не подвергающихся обработке, уже на глубине 10 —20 см количество водорослей ничтожно. По­видимому, в более глубокие горизонты   цианопрокариоты   заносятся   с   поверхности   путем   вмывания,   а также   почвенными   животными   и   корнями   растений.   Однако   и   в   полной темноте они могут оставаться живыми, а в ряде случаев даже размножаться. При   невозможности   фотосинтеза   цианобактерии   переходят   на   питание готовыми   органическими   веществами.   Правда,   их   гетеротрофный   рост   в темноте   идет   значительно   медленнее,   чем   автотрофный   рост   на   свету. 7 Многие,   несмотря   на   способность   к   усвоению   органических   веществ, нуждаются в свете и в почве сохраняются лишь в покоящемся состоянии. Поэтому в глубоких слоях почвы обнаруживается сравнительно небольшое число   видов,   преимущественно   одноклеточные   зеленые   и   желто­зеленые цианобактерии. 1.1. Общая характеристика отдела Cyanobacteria Представители   этого   отдела   –   это   просто   устроенные   организмы, осуществляющие   в   подавляющем   большинстве   случаев   оксигенный   (с выделением кислорода) фотосинтез. В отличие от эукариотных водорослей строение клетки в основных чертах соответствует строению клетки бактерий, в   связи   с   чем,   их   все   чаще   называют   цианопрокариотами   или цианобактериями. Видовое богатство этой группы организмов оценивается приблизительно в   2   тысячи   видов,   включающих   одноклеточные,   колониальные   и многоклеточные   формы.   Их   окраска   в   основном   сине­зеленая,   реже   – оливково­зеленая,   желтозеленая,   розовая,   фиолетовая,   иногда,   благодаря наличию   газовых   вакуолей,   почти   черная.   Она   обусловлена   комбинацией следующих   пигментов:   зеленого   хлорофилла   а,   синих   фикоцианина   и аллофикоцианина, красного фикоэритрина и оранжево­желтых пигментов – каротиноидов (каротина, миксоксантофилла и ряда других). Цианобактерии, как правило, микроскопических размеров и только некоторые колониальные могут достигать нескольких сантиметров [1]. Клетки не имеют морфологически оформленных хлоропластов и ядер. Протопласт разделен на окрашенный периферический слой – хроматоплазму и бесцветную внутреннюю часть – центроплазму. В центроплазме в виде гранул, палочек, сети или нитей локализована ДНК. Совокупность этих элементов представляет собой эквивалент ядра эукариот. В отличие от эукариот ДНК цианопрокариот не ограничена ядерной оболочкой и не связана с гистонами в 8 структуры,   подобные   хромосомам.   В   периферической   части   клеток   – хроматоплазме   –   локализованы   тилакоиды   –   плоские   мешочки,   которые   в поперечном сечении имеют вид пары параллельных мембран, более или менее плотно   прилегающих   друг   к   другу   и   соединенных   на   концах.   Тилакоиды, расположенные   на   периферии   клетки,   как   правило,   ориентированы параллельно клеточной стенке, но могут располагаться и перпендикулярно к ней.   Иногда   тилакоиды   рассеяны   по   всей   клетке.   С   тилакоидами   связаны фотосинтетические пигменты. Клеточные оболочки цианобактерий состоят в основном из пектиновых веществ (полисахариды) и часто ослизняются. Отличительной   особенностью   цианобактерий   является   отсутствие вакуолей,   наполненных   клеточным   соком.   Однако   у   некоторых   из   них постоянно или на определенной стадии развития образуются так называемые газовые вакуоли, или псевдовакуоли. Газовые вакуоли, рассеянные по всей клетке или располагающиеся у поперечных клеточных перегородок, состоят из  тесно  упакованных, наподобие  сот,  полых, одетых  белковой  мембраной пузырей,   заполненных   газом.   Они   уменьшают   удельный   вес   организма, способствуя его поднятию в верхние слои воды. Чаще других газовые вакуоли встречаются   у   планктонных   организмов.   Они   могут   встречаться   в  клетках либо на протяжении всей вегетативной фазы развития водоросли, либо только на определенных стадиях развития [4]. У ряда нитчатых цианопрокариот все клетки в нитях одинаковы, и такие талломы называются гомоцитными. У других нити состоят из вегетативных клеток,   гетероцист   и   акинет,   отличающихся   по   размерам   и   форме   от вегетативных клеток. Такие талломы называются гетероцитными. Цианобактерии   размножаются   главным   образом   вегетативно,   реже бесполым путем, половое воспроизведение неизвестно. В основе размножения лежит   деление   клеток,   которое   у   одноклеточных   представителей   является единственным способом их воспроизведения. Если клеточные деления быстро 9 следуют друг за другом и получающиеся клетки не дорастают до размеров материнской, то образуются наноциты. Кроме того, размножение у нитчатых форм   может   происходить   посредством   гормогоний   –   отдельных   участков трихомов,   состоящих   из   молодых   неспециализированных   клеток   и прорастающих в новые особи [2]. 1.2. Анатомическое и морфологическое строение вида Nostoc  punctiforme    очень   редко микроскопические колонии, постоянно более или менее шаровидные или реже образует   макроскопические, эллипсоидные   от   1   мм   до   1   см   и   более   (до   величины   куриного   яйца)   в поперечнике.   Внутри   колонии   плотные   или   полые,   мягкие   или   твердые, студенистые   или   иногда   хрящеватые,   почти   всегда   окружены   плотным перидермом. Трихомы рыхло или тесно лежащие, большей частью радиально расположенные.   Вегетативные   клетки   бочонкообразные,   реже   шаровидные или   эллипсоидные.   Гетероцисты   шаровидные   одиночные   или   иногда   по несколько   рядом,   обычно   крупнее   вегетативных   клеток.   Размножение посредством гормогониев [6]. 1.3. Способы питания и экология Ныне живущие виды встречаются повсеместно и могут обитать в таких экстремальных   биотопах,   как   горячие   источники   и   каменистые   пустыни. Весьма разнообразны планктонные, бентосные и свободноживущие формы в морях,   пресных   водоемах   и   почве.   Известны   цианобактерии,   живущие   в симбиозе с другими организмами. В частности они являются компонентами слоевища   многих   лишайников,   сожительствуют   с   высшими   растениями, например   с   водным   папоротником   Azolla   и   др.   Азотфиксирующие   формы важны   для   всех   биотопов,   где   они   встречаются.   Азотфиксирующие цианобактерии   широко   распространены   в  природе   и   встречаются   в  почвах (особенно обильно в тропических районах), горячих источниках, пресных и соленых водоемах со щелочным рН, на рисовых полях, реже – в морях. Они найдены   также   в   северных   областях,   в   Арктике,   в   Антарктике,   часто   –  в 10 симбиотическом  состоянии  в  составе  лишайников.  В  почвах  нашей страны азотфиксирующие   цианобактерии   распространены   повсеместно   (более   100 видов) [2]. Естественно,   что   в   клетках   водорослей   содержится   хлорофилл, благодаря которому они способны ассимилировать на свету углекислый газ (т.е.   питаться   при   помощи   фотосинтеза),   это   преимущественно   обитатели водной среды, но многие приспособились к жизни в почве и на ее поверхности, на скалах, на стволах деревьев и других биотопах. Основной   тип   питания   цианобактерий   –   фотоавтотрофный   (хотя встречаются и гетеротрофы). 1.4. Географическое распространение Разные цианопрокариоты широко распространены в планктоне и бентосе пресных водоемов и морей. Цианобактерии могут жить в горячих источниках, гейзерах   при   температуре  65­930С.   Некоторые   виды  Nostoc   встречаются   в полупустынях   Nostoc   и   другие   цианопрокариоты   встречаются   в   качестве симбионтов   во   многих   лишайниках,   их   находят   в   некоторых   простейших животных, в корнях саговников. Это одни из древнейших обитателей Земли. По   строению   клетки   цианобактерий   сходны   с   бактериями,   но   прямые филогенетические связи их маловероятны. У многих бактерий есть жгутики, споры у них образуются по­другому. Цианопрокариоты с другими группами растений связей не имеют и сохранились в примитивной форме, не дав начало каким­либо вышестоящим группам растений [8]. Живые строматолитовые маты и по сей день обнаруживаются кое­где на мелководьях   тропических   морей   (например,   залив   Шарк­Бей   на   северо­ западном берегу Австралии) и в солоноватоводных местообитаниях. Вопрос о происхождении   отдела   Cyanobacteria   до   сих   пор   не   решен.   Наиболее вероятным   является   мнение   о   дивергентном   происхождении   бактерий   и цианобактерий   от   неизвестных   нам   первичных   прокариотических   форм   и 11 более позднем историческом становлении отдела Cyanobacteria по сравнению с бактериями. 1.5. Значение цианобактерий Цианобактерии   используются   для   получения   ценных   веществ (аминокислот,   витаминов   и   др.).   Планктонные   цианобактерии   вызывают «цветение» воды. Некоторые виды могут вызвать токсичное «цветение» воды в   эвтрофных   водоемах,   представляющее   собой   опасность   для   человека   и домашнего скота. Также они имеют большое значение для обогащения почв азотом,   а   в   экосистемах,   бедных   органическими   веществами,   но   хорошо освещаемых, где гетеротрофные азотфиксаторы не могут развиваться, играют основную роль в связывании азота атмосферы [6]. 12 Глава II. Материалы и методы исследований 2.1. Материалы исследований 2.1.1. Объект исследования Систематическое положение вида Nostoc punctiforme (рис. 4) Империя Prokaryota Царство Eubacteria Подцарство Negibacteria Тип Cyanobacteria Класс Cyanophyceae Подкласс Nostocophycideae Порядок Nostocales Семейство Nostocaceae Род Nostoc Вид Nostoc punctiforme 2.2. Методика исследования 13 Для решения поставленных задач нами были использованы следующие методы: ­   эксперимент:   в   ходе   которого,   мы   проверяли   верность   выдвинутой гипотезы   с   помощью   целенаправленного   воздействия   на   объект,   путем приготовления вытяжки. ­ наблюдение: вели наблюдение внешних признаков и видимых изменений Nostoc punctiforme на протяжении определённого промежутка времени. ­ сравнение: исследование сходства и различия между вариантами опытов. ­   описание:   фиксировали   наблюдаемые   внешние   признаки  Nostoc punctiforme  исследования   с   выделением   существенного   и   отбрасыванием несущественного. В работе использовались следующие методики: ­     Гайсина   и   др.   2008:   стерилизация   посуды;   метод   посева   образцов «штрихом». ­     Кабиров,   Сугачкова   с   модификацией   2005:   методика   приготовления питательной   среды   (мясо­пептонный   агар);   методика   посева   образцов   на фильтровальную бумагу, смоченную исследуемым раствором. 2.2.1. Оборудование • Колба 100 мл; • Мясо­пептонный агар; • Чашки Петри; • Пипетка Пастера; • Фильтровальная бумага; • Маркер по стеклу; • Суспензия штамма Nostoc punctiforme (рис. 5); • Микроскоп; • Предметные стекла; • Покровные стекла; 14 • Препаровальная игла; • Электрошкаф; • Стерильный бокс. 2.2.2. Проведение эксперимента Для предварительных исследований фунгицидной активности водорослей был выбран вид Nostoc punctiforme из коллекции водорослей и цианобактерий Башкирского   государственного   педагогического   университета   имени   М. Акмуллы   (Bashkortostan   Collection   of   Algae   and   Cyanobacteria,   BCAC)   – крупнейшее   в   России   альгологическое   собрание   организмов.   Коллекция зарегистрирована  в  World Federation of Culture Collections (WFCC) (WDCM 1023). В настоящее время BCAC насчитывает 1220 штаммов, относящихся к 6 отделам:   Cyanobacteria   ­   214,   Chlorophyta   ­   815,   Streptophyta   –   52, Bacillariophyceae – 21, Xanthophyceae – 57, Eustigmatophyceae – 61 вид. Более 700 штаммов выделено с территории Южно­Уральского региона. Постановка опыта. Первая   часть   эксперимента:  вначале   посуду   тщательно   вымыли   с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной   кислоте   (хромпика).   Вымытую   посуду   ополоснули   водопроводной, затем   дистиллированной   водой   и   высушили   в   сушильном   шкафу.  Чашки Петри стерилизовали завернутыми в бумагу по 3 шт. при температуре 180оС ­ 30 минут (Гайсина и др. 2008). Далее мы приготовили алюминиевые чашечки, которые   были   необходимы   при   посеве   цианобактерий.   Затем   на   100   мл готового мясного бульона мы добавили 1 г пептона, 1 г NaCl и 0,6 г агар­агара и поставили в электрошкаф на 10 мин (по методике Кабирова, Сугачковой с модификацией (2005)). Готовый мясо – пептонный агар мы разлили в чашки Петри   в   стерильном   боксе   и   закрыли   крышками.   6   чашек   Петри   мы установили в наиболее чистой от микроорганизмов среде и в среде наиболее загрязненной на 20 минут. По истечению указанного времени чашки Петри 15 были закрыты и помещены в стерильный бокс. Цианобактерии  засевали на середину   3­х   чашек   Петри   с   питательной   средой   (рис.   6,   7).   Контролем являлись   3   чашки   Петри,   культивируемые   на   питательной   среде   без цианобактерий.   Раздельное   и   совместное   культивирование   спор   грибов, бактерий и цианобактерий продолжалось в течение 7 суток при комнатной температуре:   3   чашки   Петри   –   контроль,   с   культурами   грибов   и   бактерий, культивируемые на опытной среде без Nostoc punctiforme;   3 чашки Петри – совместное культивирование грибов, бактерий и Nostoc punctiforme.  Опыт   проводили   в   трех   повторностях,  так   как   только   одна   не   могла полностью   отразить   степень   ингибирования   роста   плесневых   грибов суспензией Nostoc punctiforme (рис. 8, 9, 10). Вторая часть эксперимента:  также был применен метод исследования, заключающийся в специальном посеве спор плесени видов Mucor, Penicillium, Sclerotinia, Aspergillus в чашку Петри,   содержащую   суспензию  Nostoc  punctiforme,   с   целью   исследовать фунгицидную   активность   суспензии  Nostoc  punctiforme  на   рост   плесневых грибов названных выше видов, споры которых присутствуют в чашке Петри с большей вероятностью (рис. 12). Все первичные приготовления оборудования идентичны приготовлениям в   предыдущем   опыте,   кроме   того,   что   к   оборудованию   прибавляется стеклянная   палочка,   с   помощью   которой   осуществлялся   посев   спор плесневых   грибов.  Далее  в чашки  Петри  с залитой  в  алюминиевые   чашки суспензии  Nostoc  punctiforme  и   чашки   контроля   были   посеяны   споры плесневых   грибов   методом   штриха   (Гайсина   и   др.,   2008),   который заключается   в   том,   что   с   помощью   стерильной   стеклянной   палочки аккуратными штрихами по застывшему мясо­пептонному агару, стараясь не 16 повредить среду, сеются споры грибов. Споры высевали в разные четверти чашки Петри по  3­4 штриха на  четверть. Культивирование  спор  грибов  и цианобактерий продолжалось в течение 7 суток при комнатной температуре (рис. 13).  Третья часть эксперимента:  наряду свыше описанными методами мы использовали   посев   мицелия   микроскопических   патогенных   грибов   на фильтровальную бумагу по методике Кабирова, Сугачковой с модификацией (2005).   Для   этого   мы   использовали   чистые   культуры   патогенных   грибов Alternaria, Fusarium, Colletotrichum. Вначале   мы   простеризовали   посуду.  Чашки   Петри   стерилизовали   с помощью сухого жара (Гайсина и др. 2008) завернутыми в бумагу по 3 шт. при температуре 180оС ­ 30 минут. Все манипуляции с культурами и стерильными материалами были проведены в ламинарном боксе. Далее мы подписали чашки Петри, приготовили фильтровальную бумагу, и поместили их в стерильный бокс.  Суспензию водорослей поместили на фильтровальную бумагу 3­х чашек Петри   (рис.   14).   Далее   мы   провели   посев   мицелия   3­х   микроскопических патогенных   грибов   (рис.   15.)   (Alternaria   ­  вызывают  заболевания  важных  паразиты   растений, сельскохозяйственных  культур;   Colletotrichum   ­ повреждают листья и стебли; Fusarium ­ широко распространены в природе и являются возбудителями заболеваний более 200 видов культурных растений, вызывая их увядание и гибель) в 3 разные чашки Петри по 10 точек (рис. 16). Две чашки Петри были контролем, в них мы посадили мицелий 3­х видов грибов и смочили дистиллированной водой. Опытные   и   контрольные   образцы   поместили   в   строго   идентичные условия (освещенность, температура). Для лучшего поддержания одинаковых условий   чашки   Петри   с   культурами   патогенных   грибов   выдерживали   в термошкафу.   Измерения   различных   показателей   проводили   через   14   дней. 17 Контрольные   образцы   выращивали   на   дистиллированной   воде, экспериментальные   –   на   суспензии   цианобактерий.   По   мере   высыхания фильтровальной   бумаги   растворы   заменялись   свежими.   Опыт   проводили   в трех повторностях (рис. 17, 18, 19). Результаты, полученные для экспериментальных образцов, сравнивали с контрольным вариантом (рис. 20).  Глава III. Результаты собственных исследований В ходе проведенных исследований по культивированию грибов, бактерий и   суспензии  Nostoc  punctiforme  были   получены   следующие   результаты, представленные в таблице 1, 2, 3. Таблица 1 18 Оценка фунгицидной активности Nostoc punctiforme на колонии микроорганизмов 1 повторность Колонии, шт Диаметр колоний, мм Средний диаметр, мм Грибы Бактерии Грибы Бактерии Грибы Бактерии С биомассой  цианобактерий Контроль С биомассой  цианобактерий Контроль С биомассой  цианобактерий Контроль 6 7 2 2 1 1 загрязненная среда 55 16 102 148 малозагрязненная среда 16 27 86 49 101 16 35 относительно чистая среда 93 47 95 9 39 17 73 17 21,14 13,5 47,5 9 17 1,56 3,06 6,31 2,19 10,33 2 Примечание.   Загрязненная   среда   –   насыщение   воздуха   микроорганизмами,   вследствие массового   скопления   людей,   где  накапливается   микрофлора,   выделяемая   через дыхательные   пути   человека,   включая   пылевое   загрязнение.   Малозагрязненная   среда   – среда, где после посещения людей, было проведено проветривание. Относительно чистая среда – относительно чистый воздух, так как 8 этаж редко посещаем людьми.  Таким   образом,  суспензия  Nostoc  punctiforme  проявляет   фунгицидную активность   на   рост   колонии   грибов,   а   на   численность   колоний   никакого влияния не оказывает. По   результатам   таблицы  1   можно   построить   диаграмму,  отражающую средний   диаметр   колоний   грибов   в   контроле,   с   культурами   бактерий, культивируемые на опытной среде без цианобактерий, и в чашках Петри при совместном культивировании грибов, бактерий и цианобактерий. Рис. 1. Средний диаметр колоний грибов (мм) первая повторность.  19 Таблица 2 Оценка фунгицидной активности Nostoc punctiforme на колонии микроорганизмов 2 повторность Колонии, шт Диаметр колоний, Средний диаметр, мм мм Грибы Бактерии Грибы Бактерии Грибы Бактерии С биомассой  цианобактерий Контроль С биомассой цианобактерий Контроль загрязненная среда 150 60 23 79 малозагрязненная среда 21 40 70 64 3 6 6 4 165 120 80 59 относительно чистая среда 7,6 13,1 11,6 16 1,1 2 3,8 1,35 4 6 90 90 С биомассой  цианобактерий Контроль Примечание.   Загрязненная   среда   –   насыщение   воздуха   микроорганизмами,   вследствие массового   скопления   людей,   где  накапливается   микрофлора,   выделяемая   через дыхательные   пути   человека,   включая   пылевое   загрязнение.   Малозагрязненная   среда   – среда, где после посещения людей, было проведено проветривание. Относительно чистая среда – относительно чистый воздух, так как 8 этаж редко посещаем людьми.  6,25 100 180 25 44 2 1,1 7,3 Таким образом,  суспензия  Nostoc  punctiforme  ингибирует рост колоний плесневых   грибов.   Данный   факт   подтверждают   результаты   опытов, проведенных в загрязненной и чистой средах. По результатам таблицы 2 можно построить диаграмму: Рис. 2. Средний диаметр колоний грибов (мм) вторая повторность.  Таблица 3 20 Оценка фунгицидной активности Nostoc punctiforme на колонии микроорганизмов 3 повторность Колонии, шт Диаметр колоний, мм Средний диаметр, мм Грибы Бактерии Грибы Бактерии Грибы Бактерии С биомассой  цианобактерий Контроль С биомассой  цианобактерий Контроль загрязненная среда 123 72 16 32 малозагрязненная среда 54 60 23 30 130 100 68 71 4 6 5 6 относительно чистая среда 4 5,3 4,6 5 1,05 1,3 1,2 1,1 20 1 2 6 С биомассой  цианобактерий Контроль Примечание.   Загрязненная   среда   –   насыщение   воздуха   микроорганизмами,   вследствие массового   скопления   людей,   где  накапливается   микрофлора,   выделяемая   через дыхательные   пути   человека,   включая   пылевое   загрязнение.   Малозагрязненная   среда   – среда, где после посещения людей, было проведено проветривание. Относительно чистая среда – относительно чистый воздух, так как 8 этаж редко посещаем людьми.  1,1 21 5 4 10 24 20 24 Таким образом,  суспензия  Nostoc  punctiforme  проявляет  фунгицидную активность. В опытах наблюдалось ингибирование роста колоний грибов, так и было отмечено уменьшение численности их колоний. По результатам таблицы 3 можно построить следующую диаграмму: Рис. 3. Средний диаметр колоний грибов (мм) третья повторность.  21 В ходе выполнения первой части эксперимента был подсчитан индекс токсичности фактора по формуле: ИТФ = М2/М1,     (1) где М1 – средний результат контроля, М2 ­ средний результат опыта. Использовали методику расчета индекса токсичности оцениваемого фактора (ИТФ) по Р.Р. Кабирову с соавт. (1997).  Для обобщения всех параметров, полученных в результате эксперимента, производили расчет M2–среднего значения диаметра колоний в эксперименте для каждого опыта (n­число повторностей опыта (в данном случае  n=3)  по формуле:  M2  =   (m1+m2+m3)/n,   где  m1­общий   диаметр   колоний   в   первой повторности;  m2­общий диаметр колоний во второй повторности;  m3­  общий диаметр колоний в третьей повторности. M2 = (46+39,3+16,3)/3=33,9 Далее   мы   рассчитали  M1  ­   средний   диаметр   колоний   в   контроле   по формуле:  M1=(m1k+m2k+m3k)/n,   где  m1k­общий   диаметр   колоний   в   первом контроле;  m2k­общий   диаметр   колоний   во   втором   контроле;  m3k­общий диаметр колоний в третьем контроле. M1=(86,6+62,3+28,6)/3= 59,2 Определяем суммарный индекс токсичности согласно формуле (1) ИТФ=M2/M1=0,576. Затем   мы   сравнивали   полученные   результаты   со   шкалой   токсичности, где:  I класс ­ сверхвысокая токсичность, вызывает гибель тест­объекта;  II – высокая токсичность (ИТФ<0,50), т. е. ниже индекса ЛД50, принятого в токсикологии;  III ­ средняя токсичность (ИТФ = 0,50–0,70);  IV ­ низкая токсичность (ИТФ = 0,71–0,90);  22 V ­ отсутствие токсичности, ИТФ на уровне контроля (ИТФ = 0,91–1,10);  VI ­ стимуляция, величина тест­функций в опыте превышает контрольные значения (ИТФ>1,1) Итого ИТФ по трем повторностям опыта равен 0,576. Из этого следует, что суспензия цианобактерии  Nostoc  punctiforme  подавляет рост патогенных грибов, т.е. обладает средней токсичностью.  Результаты   исследований   фунгицидной   активности   суспензии  Nostoc punctiforme на рост плесневых грибов представлены в таблице 4. Таблица 4 Оценка фунгицидной активности Nostoc punctiforme на рост микроскопических плесневых грибов Колонии Mucor Penicillium Повторность 1 2 2 1 3 2 Колонии плесневых грибов, шт. 1 3 0 6 Sclerotinia sclerotiorum 1 3 Aspergillus 1 2 3 4 1 1 4 Nostoc  punctiforme Контроль ср. Таким образом, суспензия  Nostoc  punctiforme  проявляет  фунгицидную активность   по   отношению   к   плесневым   грибам   видов  Mucor,  Penicillium, 15 1 1 1 3 7 7 6 2 Sclerotinia, Aspergillus. Наряду  с  изучением  влияния  Nostoc punctiforme  на  развитие  плесневых грибов  Mucor,   Penicillium,   Sclerotinia  и  Aspergillus,  мы  оценили  влияние цианобактерии  на  фитопатогенные  грибы  родов  Colletotrichum,  Fusarium  и Alternaria. Оценка фунгицидной активности Nostoc punctiforme на развитие патогенных Таблица 5 Повторность Ср. значение диаметра в опыте (мм) микроскопических грибов Виды патогенных грибов Alternaria 1 4 2 4,4 3 4,5 Colletotrichum 1 3 4,1 3,5 2 4,4 Fusarium 1 3,6 2 4,3 3 4,4 23 значение   диаметра   в Ср. значение диаметра колоний 3х повторностей (мм) Ср. контроле (мм) Процесс спороношения в опыте Процесс   спороношения   в контрольных чашках Петри + + 4,3 4,4 + + 4 4,2 ­ + 4,1 4,3 ­ + ­ ­ ­ ­ ­ + ­ ­ ­ + Практическая значимость Из   таблицы   следует,   что  суспензия  Nostoc  punctiforme  проявляет фунгицидную активность на рост колонии патогенных грибов Colletotrichum, Fusarium, Alternaria, а также оказывает воздействие на развитие патогенных грибов Colletotrichum   и Fusarium,  а  на  развитие  колоний  грибов Alternaria влияния не выявлено, т.к наблюдается интенсивный процесс спороношения.  Таким образом, дальнейшее изучение фунгицидной активности  Nostoc punctiforme  откроет   перспективы   для   применения   этого   вида цианобактерии в качестве биопестицидов. 24 Выводы 1. Суспензия   цианобактерии  Nostoc  punctiforme  проявляет   фунгицидную активность по отношению к росту колонии грибов, но на их численность существенного влияния не оказывает. 2. Суспензия   цианобактерии  Nostoc  punctiforme  не   обладает антибактериальной активностью. 3. Суспензия цианобактерии Nostoc punctiforme ингибирует рост плесневых грибов. 4. Суспензия   цианобактерии  проявляет   фунгицидную   активность   по отношению   к   росту   колонии   патогенных   грибов  Colletotrichum   и Fusarium. 5. На   рост   колоний   патогенных   грибов  Alternaria  цианобактерия   не оказывала ингибирующего эффекта, так как в эксперименте наблюдался интенсивный процесс спороношения. 6. Поставленная нами гипотеза была подтверждена: выбранный нами вид  цианобактерии может быть использован в качестве биопестицидов. 25 Литература 1. Антипина Г.С. Водоросли. Петрозаводск 1992, 112 с. 2. Балашова Н.Б., Никитина В.Н. Водоросли. Лениздат, 1989, 116 с. 3. Барсукова Т. Н., Белякова Г. А., Прохоров В. П., Тарасов К. Л. Малый практикум по ботанике. Водоросли и грибы. М., Академия, 2005, 109 с. 4. Вассер   С.   П.,   Кондратьева   Н.   В.,   Масюк   Н.   П.   и   др.   Водоросли. Справочник. ­ Киев: Наукова Думка, 1989, 608 с. 5. Гайсина   Л.А.,   Фазлутдинова   А.И.,   Кабиров   Р.Р.   Современные   методы веделения и культивирования водорослей. Уфа. 2008. – 151. 6. Гарибова Л. В., Дундин Ю. К., Коптяева Т. Ф., Филин В. Р. Водоросли, лишайники и мохообразные СССР. М., "Мысль", 1978, 365 с. 7. Горбунова Н. П. Альгология. М., Высш. шк., 1991. 256 с. 8. Дьяков Ю. Т. Введение в альгологию и микологию. М., МГУ, 2000, 192 с. 9. Еленевский А. Г., Соловьева М. П., Ключникова Н.М. и др. Практикум по систематике растений и грибов. М., ACADEMIA, 2004, 160 с. 10. Еленкин А. А. Сине­зелёные водоросли СССР. Специальная часть / А. А. Еленкин. – М. ; Л., 1938. – Вып. I. – 984 с. 11. Жизнь растений: в 6­ти т. Т. 3. Водоросли. Лишайники. М., Просвещение, 1977. 376 с. 12. Исаин В.Н., Юрцев В.Н. Ботаника.­ М.:Колос, 1966 . 13. Комарницкий Н.А., Кудряшов Л.В., Уранов А.А. Ботаника: Систематика растений. – М.: Просвещение, 1975. 14. Кузяхметов   Г.  Г.  Продукция   Ностока   обыкновенного (Nostoc commune Vauch.) в степных сообществах и ее связь с условиями местообитания / Г. Г. Кузяхметов // Биол. науки. – 1989. – № 12. – С. 45–46. 15. Курс низших растений / под ред. М. В. Горленко. М., Высш. шк., 1981. 267 с. 26 Приложение Рис. 4. Nostoc punctiforme. Рис. 5. Суспензия Nostoc punctiforme. Рис. 6. Рис. 6, 7. Посев цианобактерий. 27 Рис. 8. Первая повторность. А) Контроль, с культурами грибов и бактерий,  культивируемые на опытной среде без цианобактерий. Рис. 8. Первая повторность. Б) Совместное культивирование грибов, бактерий и цианобактерий. Рис. 9. Вторая повторность. Совместное культивирование грибов, бактерий и цианобактерий (1 ряд); контроль, с культурами грибов и бактерий, культивируемые на опытной среде без цианобактерий (2 ряд). Рис. 10. Третья повторность. Контроль, с культурами грибов и бактерий, культивируемые на опытной среде без цианобактерий (1 ряд); совместное культивирование грибов, бактерий и цианобактерий (2 ряд).  28 Рис. 11. Обработка результатов. Рис. 12. Специальный посев спор плесени видов Mucor, Penicillium, Sclerotinia sclerotinium, Aspergillus.  Рис. 13. Совместное и раздельное культивирование патогенных грибов и суспензии цианобактерий Nostoc punctiforme. Рис. 14. Пропитка фильтровальной бумаги суспензией. 29 Рис. 15. Посев мицелия на фильтровальную бумагу. Рис. 16. Патогенные грибы Fusarium и Alternaria. Рис. 17. Первая повторность.  Совместное культивирование грибов и цианобактерий. Рис. 18. Вторая повторность.  Совместное культивирование грибов и цианобактерий. 30 Рис. 19. Третья повторность.  Совместное культивирование грибов и цианобактерий. Рис. 20. Контроль, с культурами грибов, культивируемые на опытной среде без   цианобактерий. 31