Летопись важнейших открытий в химии. Инсулин – популярнейшая молекула XX столетия. Упрощенный язык биохимиков

Зябкина О.А., учитель химии МБОУ Митрофановской СОШ Летопись важнейших открытий в химии. Инсулин – популярнейшая молекула XX столетия. Упрощенный язык биохимиков Все   белки   представляют   собой   полимеры,   цепи   которых   собраны   из фрагментов   аминокислот.   Аминокислоты   –   это   органические   соединения, содержащие   в   своем   составе   аминогруппу   NH2 и   карбоксильную   группу СООН.   В образовании   белков   участвуют   только   такие   аминокислоты,   у которых   между   аминогруппой   и   карбоксильной   группой   всего   один углеродный   атом.   В общем   виде   они   могут   быть   представлены   формулой H2N–CH(R)–COOH.   Группа   R,   присоединенная   к   атому   углерода   (тому, который   находится   между   амино­   и   карбоксильной   группой),   определяет различие   между   аминокислотами,   образующими   белки.   Эта   группа   может состоять только из атомов углерода и водорода, но чаще содержит помимо С и   Н   различные   функциональные   группы.   Из всего   многообразия существующих   аминокислот   (теоретически   количество   возможных аминокислот   неограниченно)   в   образовании   белков   участвуют   только двадцать,   «фундаментальные»   аминокислоты. Для «строительства»   инсулина   природа   использовала   16   аминокислот   (из допустимых двадцати) (табл.1).   так   называемые Таблица 1 Аминокислоты, участвующие в создании инсулина Название Структура Обозначение Глицин Аланин Валин             Гли Ала ВалЛейцин Изолейцин Серин Цистеин Лизин Аргинин Аспарагин Глутаминовая кислота Глутамин Фениаланин Тирозин                                             Лей Иле Сер Цис Лиз Арг Асн Глу Глн Фен ТирГистидин Пролин         Гис Про Белковая молекула образуется в результате последовательного соединения аминокислот, при этом карбоксильная группа одной кислоты взаимодействует с аминогруппой соседней молекулы, в результате образуется пептидная связь –CO–NH– и выделяется молекула воды.  На схеме показано последовательное соединение аланина, валина и глицина.   1 Схема 1 Из превращений, показанных на схеме 1, следует, что при любом количестве соединяемых аминокислот на одном конце возникшей цепочки обязательно будет   находиться   аминогруппа,   а   на   другом   –   карбоксильная.   Фрагменты соединенных   аминокислот   обозначены   (под   фигурными   скобками)   теми сокращенными буквосочетаниями, которые указаны в табл. 1. Таким образом,вместо   структурной   формулы   мы   можем   использовать   сокращенное обозначение получившегося трипептида: ала­вал­гли. Поскольку количество аминокислот,   используемых   природой,   всего   двадцать,   то   подобные сокращения позволяют компактно записать формулу любого белка, и никакой неясности при этом не возникнет. Молекула инсулина, как установил Сенгер, состоит из 51 аминокислотного остатка (это один из самых короткоцепочечных белков) и представляет собой две   соединенные   между   собой   параллельные   цепи   неодинаковой   длины. На схеме 2 показана последовательность аминокислот в молекуле инсулина: А­цепь содержит 21 аминокислотный остаток, Б­цепь – 30. Схема 2 Содержащиеся   в   молекуле   остатки   аминокислоты   цистеина   (сокращенное обозначение Цис) образуют дисульфидные мостики S­S­, которые связывают две полимерные цепи молекулы и, кроме того, образуют перемычку внутри А­ цепи.   При   таком   компактном   изображении   белковой   молекулы   символы химических   элементов   используют   только   для   обозначения   дисульфидных мостиков и концевых групп (NH2 и COOH). Для   сравнения   далее   показана   структурная   формула   инсулина   в   виде объемной шаростержневой модели (схема 3).Схема 3 Согласитесь   с   тем,   что   биохимики   выбрали   компактный   и   необычайно удобный для написания способ изображения белковых молекул. Зябкина О.А., учитель химии МБОУ Митрофановской СОШ Летопись важнейших открытий в химии. Инсулин – популярнейшая молекула XX столетия. «От демонтажа к сборке молекулы» После того как установлена структура молекулы, синтезировать ее заново не составит большого труда. Основная   трудность   при   сборке   белковой   молекулы   –   добиться,   чтобы необходимые   аминокислоты   соединялись   в   строго   определенном   порядке. При этом нужно учитывать, что аминокислота способна реагировать не только с  другой  аминокислотой,  но  и сама  с  собой, и  в итоге  может  получиться молекула, не имеющая ничего общего с тем, что синтезирует живой организм. К   моменту,   когда   решался   вопрос   о   синтезе   инсулина,   было   разработано несколько соответствующих методик. Для того чтобы аминокислота, которую намечено было присоединить к растущей цепи, не реагировала сама с собой, ее   реакционноспособные   концы  (аминогруппу   NH2и   карбоксильную   группу СООН)   блокировали   специальным   образом:   карбоксильную   группу переводили   в п­нитрофениловый   эфир,   а   со   стороны   аминогруппы присоединяли   карбоксибензильную   группу.   Такая   блокированная   молекула реагировала с аминогруппой, находящейся на конце растущей цепи, по схеме 4 (cм. c. 8).Схема 4 В результате   растущая   цепь   удлинялась   на   одно   пептидное   звено.   Однако теперь на конце цепи разместилась блокирующая карбоксибензильная группа. Чтобы сделать «аминный хвост» реакционноспособным, т. е. перевести его в активную   форму,   осуществляли   обработку   бромоводородом   с   уксусной кислотой по схеме 5  Схема 5 В результате аминогруппа на конце цепи (она показана в виде аммониевой соли   с   HBr)   вновь   была   готова   реагировать   с   очередной   аминокислотой (естественно,   тоже   содержащей   блокирующие   группы).   Параллельно   были разработаны и другие методы сборки полипептидных цепей. Штурм вершины К полному синтезу инсулина в 1962 г. приступили практически одновременно три   группы   исследователей:   группа   П.Катсоянниса   в г.   Питсбурге   (США), группа   Г.Цана   в г.  Аахене (Германия),  а  также  группа   китайских   химиков (Шанхай   и   Пекин).   Все   три   группы   действовали   по   весьма   похожим стратегиям: собрали отдельно короткую и длинную цепи из заготовленных фрагментов, а затем соединяли обе цепи дисульфидными мостиками.Аахенская группа Г.Цана (он в центре) Короткую   А­цепь   все   три   группы   исследователей   собирали   из   двух одинаковых блоков. 1­й блок: гли­иле­вал­глу­глн­цис­цис­тир­сер; 2­й блок: иле­цис­сер­лей­тир­глн­лей­глу­асн­тир­цис­асн. Длинную Б­цепь собирали из четырех полипептидных блоков, однако длина этих блоков у разных групп ученых несколько различалась (табл. 2). Таблица 2 Полипептидные блоки для сборки Б­цепи инсулина Исследова­ тельская группа Аахенская Питсбургска Пекинско­ шанхайская 1­й блок 2­й блок 3­й блок 4­й блок Фен­вал­асн­ глн­ гис­лей­цис­ гли Фен­вал­асн­ глн­ гис­лей­цис­ гли­сер Фен­вал­асн­ глн­ гис­лей­цис­ Сер­гис­лей­ вал­глу­ала Лей­тир­лей­ вал­цис­глу Гис­лей­вал­ глу Сер­гис­лей­ вал­ глу­ала­лей­ Ала­лей­тир­ лей­ вал­цис­глу Лей­вал­цис­ глу Глу­арг­глу­ фен­фен­ тир­тир­про­ лиз­тир Глу­арг­глу­ фен­фен­ тир­тир­про­ лиз­тир Глу­арг­глу­ фен­фен­ тир­тир­про­гли тир лиз­тир Различия   возникли   из­за   того,   что   методы   соединения   блоков   и   способы промежуточной защиты, используемые каждой из исследовательских групп, были неодинаковы. Естественно, на последнем этапе у всех групп получились одинаковые цепи. Приблизительно год ушел на создание исходных блоков. Подстегиваемая   обстановкой   группа интенсифицировала работу и в декабре 1963 г. сообщила об успешном синтезе инсулина. Эта группа буквально вырвала первенство у питсбургских химиков, которые сообщили об успешном результате в марте 1964 г. Окончательный выход   чистого   продукта   колебался   в   пределах   0,02–0,07%.   У китайских химиков выход был несколько выше (1,2–2,5%); разумеется, о производстве инсулина по таким методикам не могло быть и речи. соревнования   аахенская   Питсбургская П.Катсоянниса (он второй справа)   группа Синтез   инсулина   стал   убедительной   победой   классической   синтетической химии пептидов. Несмотря на низкий выход продукта, все признавали, что была   проделана   выдающаяся   работа,   которая   позволила   изменить   образ мышления   химиков,   сформулировать   новые   принципы   сборки   больших молекул, отработать стратегию синтеза и подобрать оптимальные методики. Все это заметно повысило общий уровень органической химии. Тем не менее истинного   триумфа   не   получилось,   потому   что   почти   одновременно   с успешным   завершением   этих   работ   появилась   принципиально   иная,   более совершенная методика сборки белковых молекул. Главное – закрепить хвостПрофессор Рокфеллеровского университета (Нью­Йорк) Роберт Меррифилд, занимаясь   химией   белков,   высказал   оригинальную   идею:   первую аминокислоту   можно   закрепить   одним   концом   на   некой   нерастворимой поверхности   (носителе).   Затем   следует   присоединить   к   другому   ее   концу следующую   аминокислоту,   при   этом   нежелательные   побочные   продукты   и промежуточные реагенты, не вступившие в реакцию, можно будет вымывать из   реакционного   сосуда   после   каждой   стадии,   а   растущий   полипептид, прикрепленный   к   носителю,   останется   при   этом   незатронутым.   Молекулы растущих полипептидов будут подвешены «за хвост» к твердой поверхности носителя, а когда процесс синтеза завершится, конечный полипептид можно отделить от носителя. Меррифилду   удалось   реализовать   эту   идею.   Первую   аминокислоту присоединяют к нерастворимому полимерному гелю (сшитый полистирол) с введенными   в   него   хлорметильными   группами   CH2Cl,   которые   способны реагировать   с   СООН­группами   аминокислоты.   Чтобы   взятая   для   реакции аминокислота   не   прореагировала   сама   с   собой   и   не   присоединилась аминогруппой   к   подложке,   NH2­группу   этой   кислоты   предварительно блокируют объемистым заместителем – [(С4Н9)3]3ОС(О)­группой. После того как   аминокислота   присоединилась   к   полимерной   подложке,   блокирующую группу   удаляют   и   в   реакционную   смесь   вводят   другую   аминокислоту,   у которой также предварительно заблокирована NH2­группа. В такой системе возможно только взаимодействие NH2­группы первой аминокислоты и COOH­ группы второй аминокислоты, которое проводят в присутствии катализаторов (солей   фосфония).   Далее   схему   присоединения   повторяют,   вводя   третью аминокислоту.   Вся   схема   синтеза   полипептидных   цепей,   позволяющая чередовать   аминокислотные   остатки   в   заданном   порядке,   выглядит следующим образом (схема 6). Схема 6На   последней   стадии   полученные   полипептидные   цепи   отделяют   от полистирольной   подложки  действием  HBr в присутствии трифторуксусной кислоты F3CCOOH. аппарат, Меррифилд   не   только   экспериментально   проверил эффективность   предложенного   метода,   но   и сконструировал     который   практически автоматизировал   пептидный   синтез.   Это   устройство представляло   собой   контейнер   для   аминокислот   и реагентов   –   реакционный   сосуд   с   автоматическими впускным   и   выпускным   клапанами   и   программным механизмом,   который   регулировал   последовательность процессов и длительность каждой стадии. Р.Меррифилд  (р. 1921 г.) С   помощью   сконструированного   аппарата   Меррифилд   и   его   коллеги синтезировали   инсулин   всего   за   20   дней   (притом   с   выходом   в   десятки процентов), в то время как «первопроходцы» – аахенская, питсбургская и шанхайская группы – затратили на это больше года. В   1985 г.   Меррифилд   был   удостоен   Нобелевской   премии   «за   развитие методологии твердофазного химического синтеза». Копируем Природу Во время проведения описанных выше работ химиков не оставляла мысль, что те задачи, которые ученые решают с таким трудом, Природа решает легко и исключительно   аккуратно.   Синтез   белков   в   живых   организмах   проходит   в мягких   условиях,   быстро   и   без   образования   побочных   продуктов. До определенного  момента   химики  могли  лишь  с  удивлением   и   интересом наблюдать   подобные   «синтезы»,   однако   стремительное   развитие   биохимии позволило   активно   вмешаться   в   эти   процессы,   в   том   числе   открыть принципиально новый способ синтеза инсулина. Ранее было сказано, что Ф.Сенгер (установивший структуру инсулина) сумел определить   последовательность   фрагментов   в   структуре   ДНК,   за   что   был удостоен   второй   Нобелевской   премии.   Эта   работа   позволила   биохимикам перейти к следующему этапу – встраивать в генетический код ДНК заранее намеченные   фрагменты.   Основная   идея   состояла   в   том,   чтобы   в   ДНК некоторых   бактерий   включать   гены   высших   организмов.   В результате бактерии   приобретают   способность   синтезировать   соединения,   которые прежде   могли   синтезировать   только   высшие   организмы.   Такая   технология получила название «генная инженерия».В   1981 г.   канадский   биохимик   Майкл   Смит   был   приглашен   в   научные соучредители новой биотехнологической компании «Зимос». Один из первых контрактов   фирмы   был   заключен   с   датской   фармацевтической   компанией «Ново»   по   разработке   технологии   производства   человеческого   инсулина   в дрожжевой культуре. В результате совместных усилий инсулин, полученный по новой технологии, в 1982 г. поступил в продажу. В 1993 г. за цикл работ в этой   области   М.Смит   (совместно   с   К.Муллисом)   получил   Нобелевскую премию. В настоящее время инсулин, получаемый методом генной инженерии, практически вытеснил инсулин животных. Чьи работы важнее Итак,   мы   познакомились   с   четырьмя   способами   получения   инсулина: экстракцией   из   поджелудочной   железы   животных   (группа   Д.Маклеода), многоступенчатым   синтезом   (группа   Г.Цана), автоматизированной сборкой (Р.Меррифилд), методом генной   инженерии   (М.Смит).   Оставим   в   стороне медицинский   аспект   проблемы,   сосредоточим внимание на химии. Могло сложиться впечатление, что работы   Смита сделали   ненужными   все предшествующие исследования. На самом деле это не так, все методы неразрывно связаны, ни один из этапов упомянутых   исследований   нельзя   «выбросить». Инсулин,   выделенный   из   поджелудочной   железы животных,   позволил   Сенгеру   определить   его структуру,   а   без   этого   последующий   синтез   был невозможен.   Группа   Цана   разработала   химические приемы сборки цепей и способы промежуточной блокировки функциональных групп, которыми воспользовался Меррифилд при создании автоматической установки   синтеза.   Работы   Смита,   по   существу,   опирались   на   весь предшествующий   опыт,   накопленный   при   изучении   инсулина.   При   синтезе некоторых   короткоцепочечных   гормонов   автоматическая   установка Меррифилда технически оказалась предпочтительнее «генной инженерии». М.Смит   2000)   (1932– Обобщая,   можно   сказать,   что   все   этапы,   которые   мы   рассмотрели,   –   это естественный,   традиционный   и,   если   не   бояться   торжественных   слов, величественный путь науки.