Принципы клинической энзимодиагностики.
Оценка 5

Принципы клинической энзимодиагностики.

Оценка 5
docx
06.10.2020
Принципы клинической энзимодиагностики.
Принципы клинической энзимодиагностики..docx

Принципы клинической энзимодиагностики. Компартментализация ферментов. Изоферменты

Диагностическая энзимология основывается на 3 основных принципах в трактовке результатов.

Первый из них касается тех ферментов, которые выполняют свойственные им функции, находясь внутри клеток, а в жидкости организма попадают вследствие нарушения проницаемости клеточных мембран или даже их разрушения в результате патологического процесса. Характер и тяжесть патологического процесса определяют, какие ферменты и в каком количестве будут выходить в межтканевую жидкости, а оттуда с током лимфы в кровь и мочу. Если повреждена только наружная клеточная мембрана - выходят в основном ферменты цитоплазмы, при более глубоких поражениях клетки и повреждении мембран клеточных органелл (митохондрий, лизосом, ядер и др.) в крови появляются соответствующие ферменты. При остром процессе с гибелью большого числа клеток количественные изменения будут выражены более резко, чем при вяло текущем хроническом процессе. Эти изменения позволяют судить о глубине поражения и динамике повреждения.

Второй принцип в энзимодиагностике основывается на определении тех ферментов, которые реализуют свою биохимическую функцию, будучи секретированными из клеток в плазму крови. Понижение их активности служит признаком повреждения секретирующего органа.

Третий принцип - обнаружение ферментопатий, т.е. таких состояний, когда в результате генетических нарушений организм полностью или частично неспособен синтезировать какой-либо фермент.

Вследствие трудности непосредственного определения количества фермента, об их концентрации судят по величине активности, что позволяет обнаруживать очень небольшие количества ферментов.

Хотя активность ферментов - это способность исследуемого материала ускорять течение соответствующей биохимической реакции, а концентрация - это количество специфического белка в единице объема, согласно международной договоренности между этими понятиями, ставят знак равенства. В клинической биохимии пользуются практически всегда значениями активностей.

С целью унификации результатов лабораторных исследований была принята международная (интернациональная) единица ферментативной активности, которая выражается количеством микромолей превращенного субстрата или продукта реакции за 1 минуту. В этом случае активность фермента выражается количеством международных единиц в одном литре (МЕ/л или ИЕ/л). В системе СИ единицей активности фермента является катал, характеризующийся количеством молей превращенного субстрата или продукта реакции в секунду. Так как это очень большая величина (катал = 60000000 ИЕ), то практические расчеты проводятся с его миллиардной частью - нанокаталом (1 ИЕ=16,67 нкат). В тоже время нужно иметь в виду, что введение международной единицы и катала не решает полностью проблему унификации единиц ферментативной активности, так как различие в условиях проведения эксперимента (рН, температура, природа и концентрация субстрата, концентрация кофермента и др.) сказываются на конечном результате.

Основные пути обмена веществ являются общими для всех живых клеток. Однако в процессе эволюции произошло образование большого числа качественных и количественных модификаций этих основных форм. В организме животных дифференциация на органы и ткани сопровождалась определенными биохимическими изменениями в клетках этих органов и тканей. Эти различия носили как количественный характер, выражающийся в различной интенсивности протекающих в клетках процессов, так и качественный, обусловленный наличием в тканях реакций присущих главным образом клеткам определенных типов. Так, например, практически во всех тканях животных происходит окисление глюкозы в присутствии кислорода, но скорости этого процесса в различных тканях различны. В тоже время биосинтез стероидных гормонов происходит только в коре надпочечников, гонадах и плаценте.

Дифференциация органов и тканей в процессе роста и развития приводит к тому, что клетки специализируются в каком-то одном направлении, теряют универсальность и в них осуществляется синтез ограниченного числа ферментов необходимых для осуществления той функции, для которой предназначен данный орган или ткань.

Определяя активность ферментов в гомогенатах органов и тканей получают картину их распространения в организме животного. Некоторые ферменты обладают низкой органной специфичностью и широко распространены в тканях, отличаясь только концентрацией, другие более специфичны и обнаруживают активность только в одном или в ограниченном числе источников.

Наибольший интерес представляют те ферменты, которые специфичны для определенных органов и тканей. Фермент может иметь диагностическое значение и в том случае, когда он широко распространен, но изоферментный спектр клеток различных органов и тканей будет неодинаков, как например, в случае фермента лактатдегидрогеназы.

С развитием метода дифференциального ультрацентрифугирования, была изучена клеточная локализация ферментов. Этот метод дает возможность разделить клеточный гомогенат на четыре фракции: ядерную, митохондриальную, микросомальную и надосадочную (растворимую). Анализ отдельных фракций показывает, что ферменты, как правило, связаны с отдельным типом частиц, хотя в некоторых случаях однотипные ферменты могут обнаруживаться в различных фракциях.

В митохондриях содержатся все ферменты цикла Кребса, а также ферменты окисления жирных кислот и окислительного фосфорилирования. Это структурная специфичность может быть относительна. Если окисление жирных кислот и окислительное фосфорилирование исключительно митохондириальные процессы, то окисление пировиноградной кислоты может происходить и в других частях клетки. Однако исключительно высокая активность этого процесса в митохондриях указывает, что именно эти частицы являются ответственными за осуществление цикла Кребса. Необходимо также иметь в виду, что ферменты, катализирующие одну и туже реакцию и находящиеся в различных фракциях могут отличаться по своим характеристикам. Например, аспартатаминотрансфераза обнаруживается как в митохондриальной, так и растворимой фракциях, но эти ферменты различаются по сродству к субстрату, электрофоретической подвижностью и детерминируются различными генами. Ферменты сукцинатдегидрогеназы различаются по каталитической активности, один из них в качестве кофактора имеет НАД+, а другой - НАДФ+. В митохондриях находятся обе формы, а в цитоплазме - только НАДФ-зависимая сукцинатдегидрогеназа. Это существование функционально однотипных ферментов является, очевидно, приспособлением к особенностям метаболизма существующим в отдельных частях клетки.

Лизосомы содержат группу гидролитических ферментов имеющих оптимум рН около 5: катепсины, коллагеназу, глюкозидазы, эстеразы, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу. Эти ферменты изолированы лизосомальной мембраной, что предотвращает в обычных условиях аутолиз (это происходит когда клетки погибают). При патологических процессах, под действием лекарственных веществ, токсинов бактерий и др. лизосомы могут разрушаться, что ведет к характерному повреждению клеток и тканей. Лизосомальные ферменты играют роль в воспалительных процессах. Считается, что такой антивоспалительный агент как кортизон, оказывает свое действие, стабилизируя лизосомальную мембрану.

Микросомальная фракция представляет собой смесь продуктов разрушения мембранной системы. В микросомальной фракции находятся ферменты участвующие в биосинтезе холестерина, фосфолипидов, глицеридов. Особенно интересна группа ферментов осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков и эндогенных соединений. Эти реакции важны и в клиническом отношении, так как этим путем выводятся как естественно образующиеся продукты метаболизма (билирубин, гормоны и др.) так и многие чужеродные вещества (например, лекарственные препараты).

В ядре обнаружено около 40 ферментов, многие из которых участвуют в реализации генетической информации.

На скорость выхода ферментов из клеток действует несколько факторов. Во-первых концентрационный градиент (разность концентраций ферментов в клетках и внеклеточной жидкости). Величина концентрационного градиента колеблется для различных ферментов и типов клеток в широких пределах. Соотношение внеклеточной и внутриклеточных активностей в клетках печени для аспартат и аланинаминотрансферазы составляет 1:10000, для сорбитолдегидрогеназы 1:50000. Концентрация лактатдегидрогеназы в клетках печени примерно в 3000 раз выше, чем вне клеток, а в эритроцитах - только в 200 раз.

Вторым фактором, влияющим на скорость выхода ферментов из клеток, является размер и масса молекул ферментов. Диффузия ферментов происходит тем быстрее, чем меньше размеры и масса молекул. Третий фактор - внутриклеточная локализация ферментов. Наиболее легко при незначительном повреждении клеток в кровь будут выходить ферменты цитоплазмы, тогда как при некрозе клеток будут обнаруживаться ферменты и митохондриальной и ядерной фракций.

Нарастание содержания ферментов в крови зависит от числа и степени повреждения клеток, а также скорости повреждения клеток. Повреждение большого числа клеток в короткие сроки приводит к резкому повышению уровня ферментов в крови. Например, при отравлении четыреххлористым углеродом экспериментальных животных можно получить увеличение активности ферментов «печеночного» пула в десятки и сотни раз вследствие разрушения сразу большого числа клеток. В то же время при циррозе, даже при значительном поражении печени, увеличение активности ферментов в сыворотке крови будет незначительным, так как скорости активного повреждения клеток будут небольшие.

На содержание ферментов крови влияет также скорость удаления их из кровотока. Ферменты небольшой молекулярной массы, типа а - амилазы могут быть удалены через почки. Однако механизм удаления большинства высокомолекулярных ферментов неизвестен. Очевидно их распад катализируют специфические протеазы, обуславливающие определенную скорость разрушения фермента.

В клинико-биохимических исследованиях чаще всего реализуется первый принцип, т.е. исследуются клеточные ферменты, поступившие в кровь из органов и тканей при патологии. Для исследования активности ферментов используется чаще всего сыворотка или плазма крови. Интерпретация полученных данных основывается обычно на том, что для сыворотки крови характерны низкие значения содержания ферментов, по сравнению с их концентрацией внутри клеток.

Уровень содержания ферментов в клетках отражает процессы биосинтеза и выхода ферментов в кровь при обычном обновлении клеток. Клеточная пролиферация и повышенный ферментативный синтез, повреждения или повышение проницаемости клеточных мембран приводит к усилению выхода ферментов во внеклеточные жидкости, а затем и в кровь. Развивается гиперферментемия.

Значительно реже при патологии происходит уменьшение ферментативной активности в сыворотке крови (гипоферментемия). Это касается тех ферментов, которые будучи синтезированы в каком-либо органе реализуют свою функцию в крови. Например, фермент лецетинхолестеринацилтрансфераза (ЛХАТ) находясь в плазме этерифицирует молекулы холестерина, перенося на них жирные кислоты, находящиеся в р - положении молекулы лецетина. При поражении паренхимы печени активность фермента резко снижается. К числу плазмоспецифических относится также холинэстераза, разрушающая ацетил-холин и родственные ему вещества. При поражении клеток печени, и нарушении их синтетической функции происходит снижение активности этого фермента в сыворотке крови. К этой группе относятся также ферменты свертывающей системы крови, синтезируемые в печени и проявляющие свое действие, будучи секретированными в кровь.

Исследования активности органоспецифических ферментов в плазме или в сыворотке используют для решения вопроса о том, какой орган, в какой степени затронут патологическим процессом. Некоторые ферменты высокоспецифичны, поэтому увеличение их активности в сыворотке крови позволяет по одному этому признаку сделать правильное заключение о характере заболевания. Например, резкое повышение активности фермента орнитинкарбомоилтрансферазы, который синтезируется только в печени, свидетельствует о поражении гепатоцитов. Трипсин вырабатывается только в поджелудочной железе, поэтому увеличение активности его в крови, свидетельствует о поражении этого органа.

Другие ферменты менее специфичны, так как они могут происходить из различных органов и тканей. Органоспецифичность некоторых клинически значимых ферментов.

В клинико-биологических исследованиях широко используют, как те, так и другие ферменты. Определение высокоспецифических ферментов имеет наибольший смысл при дифференциальной диагностике, когда четко сформулирована альтернатива. Однако обратной стороной специфичности является узость. Определяя специфические ферменты, можно подтвердить или опровергнуть только данную гипотезу. Во многих случаях оправданы и менее специфические тесты. Исследуя менее специфические показатели можно сразу вычленить целую группу заболеваний.

Каждая ткань имеет свой ферментный профиль, т.е. набор ферментов наиболее характерных для данного органа или ткани и определенным образом изменяющаяся при патологии. При разрушении клеток и перехода ферментов в кровь может происходить перестройки ферментного профиля ткани связанная с неравномерной отдачей ферментов цитоплазмы и клеточных структур, адсорбцией ряда ферментов на разрушенных тканях, инактивацией и разрушением некоторых ферментов. Потому ферментный спектр сыворотки крови, характеризующий ту или иную патологию (биохимический синдром) может отличаться от ферментного профиля ткани.

В клинической ветеринарии использование ферментативных методов диагностики необходимо осуществлять комплексно, путем одновременного определения нескольких ферментов. Диагностическая ценность исследования ферментов при этом значительно повышается. Одновременное использование нескольких ферментов позволяет более полно проводить дифференциальную диагностику.

Каталитическая активность фермента обусловлена его структурой, которая, как и всех белков, определяется последовательностью оснований определенного участка ДНК, которая кодирует данный белок. Поэтому ферментативная активность в клетках следующих поколений зависит от точной транскрипции и трансляции закодированной информации. Однако в результате мутации свойства фермента могут так измениться, что он уже не сможет выполнять свою функцию.

Большинство ферментов в организме синтезируется в избытке, поэтому клиническое проявление ферментопатий наблюдается только у гомозигот (т.е. когда и отцовская и материнская хромосомы имеют генетические дефекты).

У гетерозигот, где хотя бы одна из хромосом обеспечивает выработку определенного количества фермента, клинические проявления ферментопатии могут отсутствовать. Это объясняется тем, что большинство мутантных ферментов, вызывающие врожденные пороки метаболизма, наследуются как рецессивные признаки и, следовательно, выражены только у тех особей, которые гомозиготны по мутантному гену.

Для обнаружения ферментопатии чаще всего используют ферменты форменных элементов крови. Эритроциты бедны ферментами, их энергетические потребности, необходимые для поддержания их механической целостности, формы и функции обеспечиваются ферментными системами гликолиза и пентозофосфатного пути.

Диагностическое значение исследования активности эритроцитарных ферментов значительно уже, чем плазматических. В клинико-диагностических целях ферменты эритроцитов исследуют для выявления тех ферментопатии, с которыми связаны заболевания красной крови. Обычно это гемолитические анемии. Известны гемолитические анемии, вызванные дефектами многих ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути. Наиболее хорошо изучены ферментопатии связанные с дефектами ферментов пируваткиназы, гексокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.

В некоторых случаях эритроцитарные ферменты используются для диагностики ферментопатии не связанных с патологией красной крови. В этом случае ферменты эритроцитов, служат лишь удобными генетическими маркерами. Например, дефект такого фермента эритроцитов как АТФаза, позволяет диагностировать мышечную дистрофию, фермента галактозо-1-фосфатуридин-трансферазы- галактоземию.

В ряде случаев клинико-биохимических исследований проводится определение изоферментов. Изоферменты - молекулярные формы одного и того же фермента. Они катализируют одну и ту же реакцию, но различаются по физико-химическим свойствам, сродством к субстрату, антигенными и другими свойствами. Множественность форм ферментов обусловлена двумя причинами. К первой следует отнести то, что в организме имеются множественные гены (генетические причины), каждый из которых кодирует свою субъединицу фермента, ко второй - возможность посттрансляционных изменений уже синтезированных субъединиц (ферментов).

Если в клетке синтезируется две и более субъединицы и они способны соединяться друг с другом в любых комбинациях, то образуется несколько изоферментов. Изоферменты состоящие из различных субъединиц называются гибридными. Они обладают промежуточными физическими, химическими и другими свойствами. Это хорошо наблюдается при электрофоретическом разделении изоферментов лактатдегидрогеназы, которые состоят из субъединиц двух типов НиМ.

Из них образуются пять тетрамеров - Н4, Н3М, Н2М2, НМ3, М4. Наиболее высокой электрофоретической подвижностью обладает тетрамер Н4 (ЛДГ-1) наименьшей - ЛДГ-5 (М4), остальные обладают промежуточной подвижностью. Изоферментный профиль клеток зависит от соотношения синтезируемых в ней субъединиц. Преобладать будут те изоферменты, в которые входят субъединицы содержащиеся в клетке в наибольшем количестве.

Определение изоферментов в сыворотке крови имеет важное диагностическое значение, так как распределение в тканях отдельных изоферментов более специфично, чем общей ферментативной активности. Например, в клинической диагностике довольно широко используется определение активности такого фермента, как щелочная фосфатаза. В сыворотку крови щелочная фосфатаза поступает в основном из костной ткани, печени, кишок. Поэтому при патологии этих органов активность щелочной фосфатазы будет возрастать и дифференциальную диагностику на основании определения общей активности провести нельзя. Однако «костный» и «печеночный» изоферменты различаются по своей электрофоретической подвижности и температурной устойчивостью, что позволяет проводить их раздельное определение. Увеличение активности, «костного» изофермента свидетельствует о поражении костной ткани, в то время как увеличение «печеночного» - говорит о патологии печени.

Большой интерес для клиники представляет определение изоферментов креатинфосфокиназы. Было доказано, что гибридная форма этого изофермента (MB) в большом количестве содержится только в сердечной мышце. Поэтому определение изофермента креатинфосфокиназы MB довольно специфичный показатель повреждения сердечной мышцы.

Существование изоферментов играет определенную роль в особенностях протекания гликолиза в мышцах и печени. Если в мышцах гликолиз призван обеспечить энергией процесс сокращения, то в печени его функции гораздо сложнее, здесь он более тесно связан с другими метаболическими путями.

Из 10 ферментов гликолиза 9 представлены в виде различных изоферментов, причем изоферментные спектры печени и мышц значительно различаются. Фосфофруктокиназа, альдолаза, пируваткиназа существуют в виде «печеночного» типа, которого почти нет в мышцах, и «мышечного» типа, которого очень мало в печени животных. Фермент глюкокиназа характерный для печени, отсутствует в мышцах. Все это свидетельствует о том, что какие-то этапы гликолиза в печени и мышцах протекают по-разному и это можно использовать в целях диагностики.

Широко известно изменение изоферментных спектров органов и тканей в ходе онтогенетического развития, что связано с особенностями обмена веществ на отдельных этапах эмбрионального и неонатального периодов.

Изучение изоферментов при злокачественных опухолях показало, что специализированные зрелые формы ферментов заменяются на более ранние эмбриональные формы. Установлено, что при гепатоме, изоферменты альдолазы, характерные для печени взрослого животного заменяются эмбриональными формами. Фермент гексокиназа IV, характерный для зрелых гепатоцитов, в опухолях заменяется на гексокиназу I и II, характерных для печени эмбриона.

В печени взрослых животных преобладает изофермент пируваткиназа I (печеночный тип) и в небольших количествах содержится пируваткиназа III (почечный тип). Было установлено, что в малодифференцированных быстро растущих опухолях наблюдается обратная картина: количество изофермента I снижается, вплоть до полного исчезновения, тогда как активность изофермента Ш резко повышается.


 

Принципы клинической энзимодиагностики

Принципы клинической энзимодиагностики

Основные пути обмена веществ являются общими для всех живых клеток

Основные пути обмена веществ являются общими для всех живых клеток

При патологических процессах, под действием лекарственных веществ, токсинов бактерий и др

При патологических процессах, под действием лекарственных веществ, токсинов бактерий и др

Уровень содержания ферментов в клетках отражает процессы биосинтеза и выхода ферментов в кровь при обычном обновлении клеток

Уровень содержания ферментов в клетках отражает процессы биосинтеза и выхода ферментов в кровь при обычном обновлении клеток

Каталитическая активность фермента обусловлена его структурой, которая, как и всех белков, определяется последовательностью оснований определенного участка

Каталитическая активность фермента обусловлена его структурой, которая, как и всех белков, определяется последовательностью оснований определенного участка

Изоферментный профиль клеток зависит от соотношения синтезируемых в ней субъединиц

Изоферментный профиль клеток зависит от соотношения синтезируемых в ней субъединиц
Материалы на данной страницы взяты из открытых истончиков либо размещены пользователем в соответствии с договором-офертой сайта. Вы можете сообщить о нарушении.
06.10.2020