Амилаза как объект химического исследования

Муниципальное бюджетное образовательное учреждение Средняя общеобразовательная школа №94 Ленинского района г. Н.Новгорода Научное общество учащихся «Амилаза как объект химического исследования» Работу выполнила: Фомина Лилия Дмитриевна, ученица 11 а класса  Научный руководитель: Гусева Елена Геннадьевна, учитель химии г. Нижний Новгород 2015 год Содержание: Введение……………………………………………………………................3 1. Глава 1.Сведения о ферментах………………………………….........5 1.1. Краткая история развития учения о ферментах………..........5 1.2. Химическая природа ферментов…………………...………….6 1.3. Строение и классификация ферментов …………..………...…18 1.4. Механизм действия ферментов………………………………….. 1.5. Свойства …………..   ферментов………………………………………………….. 1.6. Химико­биологическая амилазы…………………..   характеристика   фермента 2. Глава 2. Экспериментальная часть. ………………………………….. 3. Выводы………………………………….. 4. Список литературы………………………………….. 2 Введение В ходе изучения  органической  химии мы познакомились   с  рядом биологически активных   соединений:   с   гормонами,   ферментами,   витаминами   и   лекарствами. Наиболее   нас   заинтересовали   ферменты.   Ферменты,   или   энзимы,   представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемые живыми   организмами   для   осуществления   многих   тысяч   взаимосвязанных химических   реакций,   включая   синтез,   распад   и   взаимопревращения   огромного множества   и   разнообразия   химических   соединений.   Жизнь   и   многообразие   ее проявлений   –   сложная   совокупность   химических   реакций,   катализируемых специальными ферментами. И.И. Павлов считал ферменты «возбудителями всех химических превращений у живых существ». «Вся тайна животной жизни, ­ писал Д.И. Менделеев, ­ заключается в непрерывных химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей». [1] Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию. Термин «энзим» (от греческого enzyme – в дрожжах), так же как «фермент» (от латинского fermentatio   –   брожение),   означает   процесс,   связанный   с   выделением   газов, брожением. Энзимология решает две главные неразрывно связанные между собой проблемы, касающиеся с одной стороны, структурной молекулярной организацией ферментов, с   другой   –   природы   химических   взаимодействий,   лежащих   в   основе ферментативного   катализа.   Изучение   ферментов   имеет   огромное   значение   для любой   фундаментальной   и   прикладной   области   биологии,   а   также   для   многих 3 практических   отраслей   химической,   пищевой,   фармацевтической   индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, витаминов и многих других биологически активных веществ, используемых в медицине и хозяйстве. [1] Цель нашей работы – ознакомиться с общими химическими свойствами ферментов и на примере амилазы экспериментально подтвердить наличие у данного фермента        типичных ферментативных свойств.  Для достижения этой цели мы ставили следующие задачи: 1. Изучить общие сведения о ферментах по  школьным учебникам химии и биологии, дополнительной литературе, материалы Интернета. 2. Отобрать методики для исследования амилазы. 3. Провести опыты, подтверждающие наличие характерных ферментативных свойств  у амилазы. 4. Сравнить   изученные   теоретические   данные   о   ферментах   с экспериментально полученными данными о свойствах амилазы.  4 Глава 1. Сведения о ферментах 1.1 Краткая история развития учения о ферментах Явление брожения и переваривания известно с незапамятных времен. Но первое научное   представление   относится   к   первой   половине   XIX   века,   в   1814   г. петербургский  ученый  К.С.  Кирхгоф  показал,  что  не  только  проросшие  семена ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал до мальтозы. Это вещество получило название амилазы. Ю.   Либих   и   Ф.   Велер   открыли   амигдамин,   содержащийся   в   эфирном   масле горького   миндаля.   Затем   были   открыты   другие   ферменты:   пепсин,   трипсин, которые вызывают гидролиз белков в желудочно­кишечном тракте.  Значительный вклад в ферментологию или энзимологию внесли как отечественные ученые (И.П. Павлов, С.Е. Северин, В.А. Энгельгардт и др.), так и зарубежные (Э. Фишер, Дж. Нортон, А. Спаланцани, М. Дюкло и др.). Наибольшее   внимание   исследователей   привлекали   процессы   окисления   в организме. В организме в процессе превращения глюкозы до СО2 и Н2О     (C6Н12О6 2 + 6Н2О) последовательно участвует около 15 различных ферментов. + 6О2  6СО→ Биологические катализаторы не вызывают каких­либо побочных реакций.   Современные направления исследования энзимологии: 1. Исследование   молекулярного   действия   механизма   действия   и   принципы работы ферментов. Разработка теории ферментативного катализа. Изучение ферментов в соответствии с законами классической органической химии. 2. Изучение   ферментов   на   более   высоких   уровнях   (клеточном   и надмолекулярном),   но   несколько   отдельных   ферментных комплексов сложных систем.    ферментов,   сколько 3. Исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов. 4. Создание   искусственных   низкомолекулярных   ферментов   (синзимов   – синтетических аналогов ферментов). 5 5. Исследование   в   области   инженерной   энзимологии   (белковой   инженерии), создание   «гибридных»   катализаторов,   сочетающих   свойства   ферментов, антител, рецепторов, ценных для медицины и народного хозяйства.  1.2 Химическая природа ферментов Ферменты имеют белковую природу – это неопровержимые данные.  В   1926   г.   Р.   Вальштеттер   отрицал   принадлежность   ферментов   к   белкам   или   к какому­либо   известному   классу   органических   веществ.   Поводом   для   сомнений явились   опыты,   в   которых,   хотя   и   были   получены   ферментативно­активные растворы, но белок не обнаруживался при помощи качественных цветных реакций. Объясняется   это   тем,   что   концентрация   фермента   при   высокой   удельной активности оказывается ниже пороговой чувствительности химического теста на белок. О   белковой   природе   ферментов   говорит   факт   потери   активности   ферментов брожения   при   кипячении,   установленный   ещё   Л.   Пастером.   При   кипячении наступает   необратимая   денатурация   белка­фермента.   Они   теряют   свои биологические   свойства   –   антигенные,   гормональные,   каталитические.   Под влиянием   различных   физических   и   химических   факторов   (воздействие   УФ­ рентгеновского   излучения,   ультразвука,   осаждение   минеральными   кислотами, щелочами, солями тяжелых металлов) происходит денатурация ферментов, как и белков. 6 1.3 Строение и классификация ферментов В зависимости от химической природы ферменты делятся на простые и сложные (см. схему 1):   Схема 1. Ферменты Простые ферменты. Состоят из полипептидных  цепей. При гидролизе  распадаются на аминокислоты.  Ферментами такого типа  являются: пепсин, трипсин,  папаин, уреаза, лизоцим,  рибонуклеаза, фосфотаза. Сложные ферменты. Состоят из белковой  (апофермент) и небелковой   (кофермент) части.  В роли  коферментов могут выступать  Mg2+; Mn2+; Ca2+. Особенность  двухкомпонентных ферментов  состоит в том, что активностью  обладает только  совокупность  апофермента и кофермента. Для ферментов характерно наличие активного центра (рис.1). Рис.1 Активный центр фермента Активный центр фермента – уникальная комбинация аминокислотных остатков, обеспечивающая   непосредственно   взаимодействие   с   молекулой   субстрата 7 (вещества)   и   прямое   участие   в   акте   катализа.   У   сложных   ферментов   в   состав активного центра входит и простатическая группа. [1] В 1961 г. специальной комиссией Международного биохимического союза была предложена   номенклатура   ферментов.   Согласно   этой   номенклатуре   ферменты поделены на шесть групп в соответствии с общим типом реакции, которую они катализируют   (табл.   1).   В   свою   очередь,   каждый   класс   подразделяется   на подклассы и подподклассы. [3] Класс ферментов Катализируемая реакция Оксидоредуктазы Перенос атомов водорода или электронов Трансферазы Гидролазы Лиазы Изомеразы Лигазы от одного вещества к другому Перенос определенной группы атомов –  метильной, ацильной, фосфатной или  аминогруппы – от одного вещества к  другому Реакции гидролиза Негидролитическое присоединение к  субстрату или отщепление от него группы атомов. При этом могут разрываться  связи C – C, C – О или C – S Внутримолекулярная перестройка Соединение двух молекул в результате  образования новых связей C – C, C – N, C  – О или C – S, сопряженное распадом  АТФ 1.4 Механизм действия ферментов Таблица 1. Примеры  ферментов или их  групп Дегидрогеназа Трансаминаза,  киназа Липаза, амилаза,  пептидаза Декарбоксилаза,  фумараза,  альдолаза Изомераза, мутаза Синтетаза Механизм   каталитического   действия   ферментов     является   слитным.   Слитный механизм каталитического действия заключается в том, что переход от исходных веществ   к   продуктам   переходит   постепенно   через   образование   активированных комплексов с участием катализатора, которые невозможно выделить в свободном состоянии,   но   иногда   можно   зафиксировать   с   помощью   физических   методов исследования. [4] 8 1. В анаболических реакциях, протекающих по типу A + B  AB→ , фермент (E) может соединяться как с одним, так и с другим субстратом (см. схема 2): E ЕА ЕВ ЕАВ  Е +АВ →                  Схема 2. Е – фермент,      А, В – реагенты,  ЕАВ – промежуточный комплекс,  АВ – продукт. 2. Реакции   метаболизма,   протекающие   по   типу  АВ   ферментов можно отразить схемой  3: →   А   +   В ,   с   участием Схема 3.   АВЕ→  А + ВЕ        (а+b+c): АВ + Е  →  А + В + С a) АВ + Е  → b) АВЕ  → c) ВЕ   В + Е                               .  АВ – реагент, Е – фермент,      АВЕ – промежуточный комплекс,  ВЕ – промежуточный комплекс,  А – продукт, В – продукт. Подобно   другим   катализаторам   ферменты,   с   термодинамической   точки   зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации, необходимой для перевода молекул в активное состояние при данной температуре. [1] 1.5 Свойства ферментов Ферменты обладают свойствами, отличными от неорганических катализаторов. (см. табл. 2) «Различия между неорганическими катализаторами и ферментами» [3] Таблица 2. 9 Признаки различий Химическая природа Дисперсная система Селективность Оптимальное значение рН­среды Изменение структуры катализатора в ходе реакции Увеличение скорости реакции Неорганические катализаторы Низкомолекулярные вещества, образованные одним или несколькими элементами Грубодисперсные. Преобладают пена, аэрозоли, эмульсии Низкая Ферменты Белки – высокомолекулярные полимеры Коллоидная система Очень высокая Сильнокислая или Небольшой физиологический щелочная интервал рН­среды Изменяется незначительно или не изменяется вовсе Изменяется в значительной степени и восстанавливается в В 102 – 106 раз исходную структуру по окончанию реакции В 108 – 1012 раз Активность ферментов. Под активностью ферментов понимают начальную скорость химической реакции, катализируемой ферментами, например в мкмолях превращающегося субстрата в 1 мин или мкмолях образующегося продукта в 1 мин.  В настоящее время используют две единицы ферментативной активности: a) Стандартная   единица   U   (или   единица   активности)   [Enzime Nomenclature, Recommendations, 1964] b) Катал [Enzime Nomenclature, Recommendations, 1972].  Единица   активности   (U)   фермента   –   это   такое   его   количество,   которое   при определенных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин, или если атаке подвергается более, чем одна связь в молекуле субстрата, 1мкэкв (группы) в 1 мин. 1   катал   (кат)   –   это   такая   каталитическая   активность,   которая   увеличивает скорость реакции на 1 моль/с в определенной тест­системе. В   обоих   случаях   оговариваются   условия,   т.е.   температура,   рН,   концентрация субстрата. 10 Удельная   активность   в   первых   двух   случаях   выражается   соответственно мкмоль/мин*мг   или   ед.   акт/мг.   Если   ферментативная   активность   выражается   в каталах, удельная активность должна быть представлена в кат/кг. 1мкмоль/мин = 1 ед. акт. = 16,67 мкат. [2] Факторы, влияющие на активность ферментов:  Т.е. факторы, определяющие скорость реакций, катализируемых ферментами.  Со   временем   скорость   реакции   уменьшается.   Это   может   быть   объяснено угнетающим  действием   на  фермент  продуктов  реакции,  уменьшение количества субстрата, инактивацией фермента, влиянием скорости обратной реакции, которая может оказаться существенной по мере накопления продуктов реакции. Поэтому, учитывая эти обстоятельства при исследовании скорости химических реакций в тканях, биологических жидкостях, определяют начальную скорость реакции. a) Влияние концентрации субстрата.  При   постоянной   концентрации   фермента   скорость   реакции   постепенно увеличивается,   достигает   определенного   максимума.   Дальнейшее   повышение концентрации   субстрата   практически   не   влияет   на   скорость.   В   этих   случаях принято   считать,   что   субстрат   находится   в   избытке,   и   фермент   полностью насыщен. Скорость   любой   ферментативной   реакции   зависит   от   концентрации   фермента. Скорость реакции прямо пропорциональна количеству фермента. b) Активирование и ингибирование ферментов. Активаторы   повышают   активность   фермента.   Соляная   кислота   активирует действие   пепсина;   желчные   кислоты   –   панкреатической   липазы.   Активатором может   быть   витамин   С.   Особенно   часто   активатором   могут   являться   ионы двухвалентных металлов: Анионы при физиологических концентрациях оказывают небольшое активирующее действие   на   ферменты.   некоторые   Исключение   составляет   пепсин, оксидоредуктазы,   активизируемые   анионами,   а   также   амилаза   слюны, 11 катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора Cl­, аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов. c) Ингибиторы   –   вещества,   вызывающие   частичное   торможение   или полное торможение реакции. Ферменты   имеют   белковую   природу,   поэтому   любые   агенты,   вызывающие денатурацию   белка   (нагревание,   кислоты,   щелочи,   соли   тяжелых   металлов), приводят к инактивации ферментов. [2] d) Термолабильность Термолабильность   –   это   чувствительность   к   изменению   температуры.   Однако вследствие   белковой   природы  тепловая   денатурация   фермента   уменьшает эффективную денатурацию фермента. Обычно в температурном интервале 40 – 50 ºC скорость ферментативных реакций максимальна.   Выше   50   ºC   скорость   снижается,   т.к.   начинает   сказываться денатурация.   При   температуре   100   ºC   почти   все   ферменты   утрачивают   свою активность.   Оптимальной   температурой   для   действия   фермента   животного происхождения   является   tº=   37   –   40   ºC.   При   0   ºC   оптимальная   активность ферментов   падает   почти   до   0,   но   фермент   при   этом   не   разрушается.   На Термолабильность оказывает влияние концентрация субстрата, рН­среда и другие факторы. [1] e) Зависимость от рН­среды Как показывают литературные данные, рН­оптимум действия фермента лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин.  рН­оптимум равен 2,0 (при рН 6,0 он не активен и нестабилен), это связано с тем, что он входит в состав желудочного сока, где есть свободная соляная кислота.  рН­оптимум аргиназы лежит в сильно щелочной среде (рН 10,0), в клетках печени такой среды нет, поэтому in vivo аргиназа функционирует не в своей оптимальной среде. «Оптимальное значение рН­среды для ферментов». [1] f) Специфичность ферментов 12 Ферменты обладают высокой специфичностью. Это свойство существенно отличает их от неорганических катализаторов. Так мелко измельченная платина и палладий могут катализировать восстановление с участием молекулярного водорода десятки тысяч   химических   соединений   различной   структуры.   Высокая   специфичность   электростатической фермента комплементарностью   между   молекулами   субстрата   и   фермента,   уникальной конформационной обусловлена     и   структурой его активного центра фермента, который обеспечивает  «узнавание», высокое   сродство   и   избирательность   протекания   какой­либо   одной   реакции   из тысяч других реакций, осуществляющихся в живых клетках. Учитывая высокую специфичность ферментов, ещё в начале XX века была выдвинута гипотеза «ключа и замка», т.е. точного соответствия молекул фермента (замок) и субстрата (ключ). Однако фермент и субстрат – это гибкие структуры, а «ключ­замок» предполагает жесткость структуры, поэтому гипотеза неточно отражала действие ферментов. В середине   XX   века   была   высказана   мысль   о   динамическом   влиянии   между ферментом   и   субстратом.   Эту   идею   назвали   гипотезой   индивидуального соответствия. Ее называют «рука­перчатка».  Пепсин   расщепляет   белки   животного   и   растительного   происхождения,   которые могут   отличаться   по   аминокислотному   составу,   физико­химическим   свойствам. Пепсин не расщепляет жиры, углеводы. Место его действия – пептидные связи −CO−NH− . Местом  действия  для  липазы,  катализирующей  гидролиз  жиров  до  глицерина  и высших карбоновых кислот, является сложно эфирная связь. Аналогичной   групповой   специфичностью   обладают   трипсин,   химотрипсин, β , α ­гликозидные   связи   (   но   не     пептидаза,   ферменты,   которые   гидролизируют   которые имеются в целлюлозе) в полисахаридах. 13 Имеются   экспериментальные   данные   о   стереохимической   специфичности, обусловленных   существованием   оптически   изомерных   L­   и   D­форм   или геометрических (цис­ и транс­) изомеров химических веществ. Фумараза действует на фумаровую кислоту.   Однако   не действует на малеиновую.  Таким   образом,   благодаря   специфичности   действия   ферменты   обеспечивают протекание   с   высокой   скоростью   лишь   определенных   реакций   из   огромного разнообразия возможных превращений в микропространстве клеток и целостном организме, регулируя тем самым обмен веществ. [1] 1.6 Химико­биологическая характеристика фермента амилазы Амилазы (от лат. Amylum – крахмал) ­ ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз   крахмала,   гликогена   и   других   родственных   олиго­   и   полисахаридов, главным образом, по 1,4 глюкозидной связи. Различают несколько типов амилаз: 1. α ­Амилаза ( Mr  = 50 тыс.) участвует в гидролизе  cахаров, содержащих подряд три или более остатков глюкозы. Расщепление связей может происходить между   любыми   остатками   глюкозы,   причем   остатки   моносахаридов   в   месте Α ­Амилаза   превращает   амилозу разрыва   имеют   конфигурацию   мономеров.   крахмала   в   глюкозу   и   мальтозу.   Находящийся   в   крахмале   амилопектин, содержащий   в   молекуле   1,6   связи,   полностью   не   гидролизуется   –   остается Α ­Амилаза обладает разветвленный полисахарид, т. наз. «остаточный декстрин».  слабокислыми свойствами. Ионы Са2+  и  Cl­  активируют ее. Присутствует во всех тканях   животных   и   растений,   а   также   в   микроорганизмах.   По   каталитической активности ферменты из разных источников значительно отличаются друг от друга. Α ­Амилаза   слюны,   поджелудочной   железы   и   слизистой   кишечника   участвуют   в переваривании пищи,  ­Амилаза печени расщепляет гликоген. α 14 β 2. ­Амилаза   ( Mr  =   50­200   тыс.)   последовательно   отщепляет   остатки мальтозы от невосстанавливающего конца цепи полисахаридов. Под действием  ­β Амилазы из амилозы образуется мальтоза, а из амилопектина также "остаточный декстрин". Содержится  ­Амилаза в солоде.  β (экзо­1,4альфа­глюкозидаза; 3. γ ­Амилаза     50­100   тыс.) последовательно   отщепляет   концевые   остатки   альфа­D­глюкозы   от Mr  =.   невосстанавливающих   концов   цепей   полисахаридов   с   образованием   бета­D­ глюкозы.   Способна   также   расщеплять   1,6   альфа­связь,   если   следующие   за   ней моносахариды соединены в положениях 1 и 4. Содержится в плесневых грибах. [9] Амилазы   применяются   в   пивоваренной,   текстильной   промышленности,   в ­амилаза   используется   в  пивоварении хлебопекарном   производстве.  Например,  для осахаривания содержащегося в солоде крахмала,  ­Амилаза используется для γ α производства глюкозы. [3] Глава 2. Экспериментальная часть Приборы и оборудование: 1. Два стаканчика на 150 мл и 1 стакан на 400­500 мл. 2. Воронка, фильтры. 3. Штатив с маленькими пробирками. 4. Электронный термометр ЦЛ «Архимед» 5. Пипетки для отбора проб. 6. Промывалка с дистиллированной водой. 7. Лед. 8. Водяная баня. 9. Планшеты, для проведения опытов капельным методом.  Приготовление разведенной слюны. Прополоскать   рот   два   раза   дистиллированной   водой   для   удаления   остатков пищи. Затем взять в рот 20 мл дистиллированной воды и держать ее во рту около 2 минут. Полученную жидкость слить в стаканчик и профильтровать через бумажный 15 фильтр. Жидкость представляет собой раствор слюны, которая содержит амилазу –   фермент,   катализирующий   гидролиз   1,4­гликозидных   связей   в   молекулах крахмала. Опыт   №1.   «Определение   активности   амилазы   в   растворе   слюны   по Вольгемуту»[5]. Метод   основан   на   определении   наименьшего   количества   амилазы   (при максимальном   разведении   слюны),   полностью   расщепляющей   весь   добавленный крахмал.   Амилазная   активность   слюны   выражается   объемом   (в   мл)   0,1%­ного раствора   крахмала,   который   расщепляет   1   мл   неразведенной   слюны   при температуре   38   °C   в   течение   30   мин.   В   норме   амилазная   активность   слюны составляет 160­320 единиц. В 10 пробирок наливаем по 1 мл дистиллированной воды и в первую из них добавляем   1   мл   разведенной   в   10   раз   слюны.   Перемешиваем   содержимое   этой пробирки   и   переносим   1   мл   смеси   во   вторую   пробирку.   Содержимое   второй пробирки   также   перемешиваем,   переносим   1   мл   смеси   в   третью   пробирку   и продолжаем так делать до десятой пробирки. Из десятой пробирки выливаем 1 мл смеси. Во   все   пробирки   добавляем   по   1   мл   воды   и   по   2   мл   0,1%­ного   раствора крахмала,   перемешиваем   содержимое,   встряхиваем   пробирки   и   помещаем   их   в водяную   баню   при   38   °C   на   30   мин.   После   инкубации   пробирки   охлаждаем холодной   водой,   добавляем   в   них   по   1   капле   0,1%­ного   раствора   йода   и перемешиваем.  Гидролиз   крахмала:  Крахмал   (С6Н10О5)n  → → таблицу 5 эритродекстрин мальтодекстрин мальтоза С ­ахродекстрин 6Н12О6. Результаты заносим в →­ахродекстрин 12Н22О11  глюкоза С → 6Н10О5)m,   (m<   n) → амилодекстрины   (С →γ     → Таблица 5. 16 Номер  пробирки Разведение  слюны Цвет  раствора I2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1:20 1:40 1:80 1:160 Желтый Желтый Желтый Сиреневы й 1:128 0 Сини й 1:2560 1:512 0 1:10240 Синий  Ярко­ синий Темно­ синий 1:32 0 Сир енев ый 1:6 40 Св етл о­  син ий При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтый (мальтоза), оранжевый (ахродекстрины), красный (эритродекстрины) и синий (крахмал) цвета. Отмечаем пробирку №3, в которой гидролиз прошел полностью, и делаем расчет.  Третья   пробирка   –   последняя,   в   которой   гидролиз   прошел   полностью   (в четвертой наблюдается сиреневое окрашивание).  Можно составить пропорцию:  1/80 мл слюны расщепляет 2мл 0,1%­ного раствора крахмала 1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1%­ного раствора крахмала Х= 2•1/1/80 = 160 (мл) Следовательно, 1 мл неразведенной слюны расщепляет за 30 мин при 38 °С 160 мл 0,1%­ного раствора крахмала. Активность  амилазы слюны равна 160   единиц.   Результат   показал,   что   активность   исследуемой   амилазы   слюны   в норме (фото1,2) [5] 17 Опыт №2. «Доказательство белковой природы фермента амилаза с помощью цветных реакций». [3] 1. Реакция Фоля. Обнаружение сульфид ионов (S2­) в растворе слюны. К   раствору   слюны   приливаем   растворы   гидроксида   натрия  NaOH  (10­12%)   и ацетата   свинца   (10%)   Рb(СН3СОО)2.   Нагреваем   пробирку   со   смесью.   Отмечаем лишь   помутнение   смеси.   Изменение   окраски   не   происходит.   Черный   осадок сульфида свинца (II) не образуется. (  фото 3) 2. Ксантопротеиновая реакция. В пробирку наливаем 2­3мл раствора слюны и добавляем несколько капель конц. HNO3  (1:3).     Нагреваем   содержимое   пробирки,   при   этом   образуется   желтый осадок.   Охлаждаем   смесь   и   добавляем   раствор   аммиака   до   перехода   желтой окраски в оранжевую. Желтое окрашивание наблюдается в результате нитрования бензойных колец в составе аминокислотных остатков, что подтверждает белковую природу амилазы. ( фото 4) 3. Биуретовая реакция. 18 В   пробирку   наливаем   2­3   мл   раствора   слюны   и   приливаем   2   мл   растворов гидроксида натрия NaOH (10­12%) и сульфата меди (II) (с=0,5 моль/л). Фиолетовое окрашивание не наблюдалось. ( фото 5) Опыт №3. «Сравнение кислотного и ферментативного гидролиза крахмала». [7] Для   проведения   этого   опыта   было   приготовлено   2   пробирки,   в   которых находились:  1­ая пробирка ­ 3мл 1%­го раствора крахмала, 3мл раствора слюны.  2­ая пробирка ­ 3мл 1%­го раствора крахмала, 3мл 0,1 н раствора соляной кислоты (HCl). С растворами из этих двух пробирок были проведены йодные пробы на крахмал капельным   методом.   Затем   обе   пробирки   были   помещены   на   водяную   баню температурой 37С. И через каждые 2 минуты делалась повторная йодная проба на наличие крахмала. Данные представлены в таблице №6: № 1. 2. 3. Время от начала гидролиза, мин Крахмал + амилаза Крахмал + HCl 0 2 4 + + + + ­ ­ 19 Таблица 6. «+» ­  положительная  проба  крахмала  на йод; «­»­  отрицательная  йодная проба на  крахмал. Опыт   показал,   что   при   комнатной   температуре   скорость   ферментативного гидролиза   крахмала   значительно   больше,   чем   кислотного,   но   крахмал обнаруживается в обеих пробах. Через 2 минуты после выдерживания в водяной бане при температуре 37С ферментативный гидролиз заканчивается, а кислотный гидролиз продолжается и заканчивается через 10 минут от начала опыта. ( фото 6) Опыт №4. «Термолабильность амилазы». [7] В чистую пробирку отливаем 2­3 мл раствора слюны и кипятим в течение 5 ­7 минут, после чего охлаждаем. В три пробирки наливаем по 1 мл 1%­ного раствора крахмала. В первую пробирку наливаем 1 мл прокипяченного раствора слюны, во вторую и третью – по 1 мл обычного   раствора   слюны.   Первую   и   вторую   пробирки   помещаем   на   5минут   в водяную баню с температурой 37­40 °С, а третью пробирку – в баню со льдом. Далее   третью   пробирку   изо   льда   помещаем   на   5   минут   в   водяную   баню   с температурой 37­40 °С и, охлаждаем. Исследуем растворы всех трех пробирок  на реакцию йода на крахмал капельным методом. Результаты опыта записываем в виде таблицы7: Субстрат 1.Крахмал Фермент Кипяченая амилаза Температура 37­40°С 20 Таблица 7. Реакция на йод + 2.Крахмал 3.Крахмал Амилаза Амилаза 37­40°С 0 °С 37­40°С «+» ­ положительная проба крахмала на йод;  ­ + ­ «­» ­ отрицательная йодная проба на крахмал. Результаты   опыта   показали,   что   при   кипячении   амилазы   происходит   утрата   её естественной   активности,   гидролиз   крахмала   не   происходит.   Причина   этого­ денатурация белка фермента, разрушение IV­III­II структур белка. При температуре 37­40 °С гидролиз крахмала происходит полностью.  В третьей пробирке гидролиз прошел не полностью, низкие температуры понижают активность   амилазы,   но   не   разрушают   ее   ферментативные   свойства.   Гидролиз крахмала   происходит   только   до   декстринов,   о   чем   свидетельствует   появление оранжево­коричневого окрашивания. ( фото 7) Опыт №5. «Влияние рН­среды на активность амилазы». [7] В три пробирки наливаем по 1 мл раствора крахмала. В первую добавляем 3 капли 0,1 н. раствора соляной кислоты (HCl), во вторую – 3 капли дистиллированной воды, а в третью – 3 капли 0,1 н. раствора едкого натрия (NaOH). Затем во все три пробирки   добавляем   по   1   мл   раствора   амилазы   и   помещаем   их   на   5   минут   в водяную   баню   с   температурой   37­   40   °С.   Далее   в   третью   пробирку   для нейтрализации   добавляем   3   капли   0,1   н.   раствора   соляной   кислоты,   так   как   в щелочной среде реакция с йодом на крахмал не идет. С растворами всех  трех пробирок проводим реакцию с йодом на крахмал. Данные заносим в таблицу № 8: 21 Таблица 8. Субстрат 1. Крахмал 2. Крахмал 3. Крахмал Среда HCl Н2О NaOH Фермент Амилаза Амилаза Амилаза Проба на йод ­ + + «+» ­ положительная проба на йод;  «­» ­ отрицательная йодная проба Результаты этого опыта позволяют сделать выводы:    Кислотная   среда   усиливает   процесс   гидролиза   крахмала   амилазой,   что выражается в желтом окрашивании йода в данном растворе.  В   нейтральной   среде   гидролиз   происходит   с   меньшей   скоростью,   чем   в кислотной,   о   чем   свидетельствует   зеленое   окрашивание.   Это   результат наложения синего и желтого цветов.    . Щелочная среда подавляет гидролиз крахмала, йодная проба на крахмал дает раствор синего цвета. ( фото 8) 22 Опыт №6. «Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы». [7] В три пробирки наливаем по 1 мл раствора слюны. В первую пробирку добавляем 2 капли 1%­ного раствора хлористого натрия (NaCl), во вторую – 2 капли 1%­ного раствора сульфата меди (II) (CuSO4), а в третью – 2 капли дистиллированной воды. Затем в каждую пробирку добавляем по 1 мл 1%­ ного раствора крахмала. Все три пробирки на 2 минуты помещаем в водяную баню с температурой 37­ 40 °С. После этого пробирки охлаждаем и добавляем в каждую по 3 капли раствора йода для проведения йодной пробы на крахмал. Результаты заносим в таблицу 9: Таблица 9. № пробы Субстра т Фермент Проба на йод 1 2 3 Крахмал Амилаза + NaCl Крахмал Амилаза + CuSO4 Амилаза + Н2О Крахмал ­ + ­ «+» ­ положительная проба  крахмала на йод;  «­» ­ отрицательная йодная проба на крахмал. Гидролиз прошел полностью в контрольной пробирке с водой и в пробирке, где был добавлен раствор хлорида натрия (цвет растворов желтый). В пробирке, где был добавлен сульфат меди (II), гидролиз прошел не полностью (цвет растворов сине­ зеленый). Окраски   растворов   позволяют   сделать   вывод,   что   сульфат   меди   (II)   является ингибитором   для   амилазы   (уменьшает   ее   активность),   а   хлористый   натрий   – активатором амилазы (усиливает активность). ( Фото 9) 23 Опыт   №7.   «Исследование   ферментативного   гидролиза   крахмала   под действием амилазы». [3,6] 1) Исследование времени гидролиза крахмала.[3] Для проведения этого опыта была приготовлена 1 пробирка, содержавшая 5мл  Через каждые 30 секунд снималась йодная проба. Результаты представлены в таблице 10: Таблица 10. Время 0 30 сек 1мин 1,30 2 230 3 3,30 4 4,30 5 5,30 6 6,30 7 7,30 8 8,30 Цвет Т.­синий Т.­синий Т.­синий Т.­синий Т.­синий Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый коричневый коричневый коричневый коричневый светло­коричневый светло­коричневый Темно­желтый 24 Продукт гидролиза              Крахмал Аилодекстрин Аилодекстрин Аилодекстрин Аилодекстрин Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтоза Мальтоза Мальтоза 9 9,30 10 10,30 11 Темно­желтыйо Желтый Желтый Желтый Желтый Мальтоза Глюкоза Глюкоза Глюкоза Глюкоза  После проведения опыта было установлено, что полный гидролиз крахмала при комнатной температуре проходит за 9 минут и 30 секунд.  Во время опыта мы наблюдали различные изменения окрашивания: от темно­ синего – красно­коричневого – коричневого – светло коричневого – темно­ желтого – до желтого, что свидетельствует от том, что гидролиз крахмала происходит ступенчато. (фото 10) 2) Исследование   ферментативного   гидролиза   крахмала   под   действием α β ,  амилаз, полученных их развивающихся семян ячменя.[6] Для проведения опыта были предварительно приготовлены ферментные препараты α­ и β­ амилаз: Развивающиеся   семена   ячменя   растираем   в   ступке,   полученную   массу   дважды обрабатываем   на   холоде   таким   же   объемом   дистиллированной   воды,   экстракт фильтруем через полотно. 25 Нагреваем 7,5 мл воды до 70 °С, добавляем 2,5 мл экстракта и оставляем смесь на 20   мин,   периодически   встряхивая.   При   70   °С  β­   амилаза   инактивируется,   в растворе остается лишь α­ амилаза. Реактивы охлаждаем в холодильнике при 0 °С в течение 0,5ч. Затем 5 мл экстракта перемешиваем с 3 мл 0,1М соляной кислоты, добавляем 10 мл подкисленной воды (рН 3,2), через 15 мин добавляем 5,4 мл 0,066М раствора гидрофосфата и объем смеси доводим до 20 мл. В таких условиях α­амилаза инактивируется, в растворе остается β­амилаза. o В 10 пронумерованных пробирок наливаем по 3,9 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,2%­ного раствора крахмала. В нечетные пробирки добавляем по 0,1 мл раствора  α­амилазы, а в четные – по 0,1 мл раствора  β­амилазы. Затем проводим инкубацию при 38 °С на водяной бане: для первой пары пробирок ­ в течение 2,5 мин, второй – 5мин, третьей – 10 мин, четвертой – 20мин, пятой – 30 мин. После инкубации в пробирки добавляем по капле раствора йода, приготовленного с добавлением йодида калия. Результаты заносим в Таблицу 11: Таблица 11. № пробирки α ­амилиза Йодная проба цвет β ­амилаза Йодная проба цвет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ­ ­ ­ + + кремовый Розово­сиреневый красный синий Темно­синий + + + + + Темно­синий, очень  Темно­синий  Более синий синий Светло­синий «+» ­ положительная проба крахмала  на йод;  «­» ­ отрицательная йодная проба на крахмал. 26 o Результаты   опытов   показывают,   что   под   действием  α­амилазы   крахмал расщепляется на декстрины, о чем свидетельствует образование характерной гаммы окрасок: красной, сиреневой, синей. ( фото 11) o В   присутствии  β­амилазы   декстрины   не   образуются,   во   всех   пробирках наблюдается   синяя   окраска,   интенсивность   которой   по   мере   расщепления крахмала уменьшается. (См фото 12) Опыт №8. «Специфичность амилазы». [7] В две пробирки наливаем по 1 мл раствора слюны. В первую пробирку добавляем 1 мл 1%­ного раствора крахмала, а во вторую – 1 мл 1%­ного раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки хорошо перемешиваем и помещаем обе пробы на 5 минут в водяную баню с температурой 37­40 °С. Затем обе пробы охлаждаем и, 27 разделив   пополам,   проделываем   реакции   с   йодом   и   с   реактивом   Феллинга   при нагревании. Результаты записываем в Таблице 12: Таблица 12. Субстра т Крахмал Амилаза Сахароза Амилаза Фермент Реакция с йодом Реакция с реактивом Феллинга ­ ­ Появление   кирпично­ красного осадка Изменений не произошло «+» ­ положительная проба на йод;  «­» ­ отрицательная йодная проба  n C→ 6H12O6; глюкоза (C5H10O5)n + nH2O  крахмал C6H12O6     + 2Сu(OH)2  глюкоза Опыт   показал,   что   амилаза   является   специфичным   ферментом   и   катализирует  C→ 6H12O7 + Cu2O + 2H2O глюконовая кислота только   процесс   гидролиза   крахмала,   но   не   является   ферментом   для   гидролиза дисахарида сахарозы С12Н22О11. 28 Выводы На основе проведенной работы можно сделать вывод, что амилаза– биологический катализатор   белковой   природы,   ускоряющий   химическую   реакцию   гидролиза крахмала в живых организмах и вне . ­α Все четыре вида амилаз имеют белковую природу – это неопровержимые данные. Амилаза  слюны обладает  общими для всех   белков свойствами:  способностью к растворению   в   воде   и   образованию   коллоидных   растворов;   амфотерностью; способностью   к   денатурации   и   гидролизу;   возможностью   протекания   цветных реакций.   Активность   амилазы   в   растворе   слюны   по   Вольгемуту   составила   160 единиц, это свидетельствует о том, что 1 мл неразведенной слюны расщепляет за 30 мин при 38 °С 160 мл 0,1%­ного раствора крахмала. Проведенные эксперименты показали,   что   активность   слюны   зависит   от   следующих   факторов:  pH  –  среды, температуры,   химических   добавок.   Кислотная   среда,   температура   37­40   °С, раствор хлорида натрия увеличивают активность амилазы, высокая температура, кипячение,   добавки   растворов   солей   тяжелых   металлов,   в   частности   растворов 29 сульфата меди (II), растворы щелочей, а именно гидроксида натрия – уменьшают активность   амилазы,   приводят   к   ее   денатурации,   утрате   естественных ферментативных   свойств.   Скорость   ферментативного   гидролиза   крахмала   под действием амилазы намного больше скорости кислотного гидролиза крахмала при одинаковых условиях. Результаты опытов гидролиза сахарозы ­амилазы слюны и   и  ­β гидролиз крахмала под действием  ­амилазы подтвердили, что ферменты   β амилаза обладают специфичностью. Слюна представляет собой суммарный секрет всех слюнных желез, включат также микрофлору,   содержимое   десневых   карманов,   десневую   жидкость,   лейкоциты, остатки   пищевых   продуктов,   а   также   белки:   амилазу,   лизоцим,   альбумины, глобулины,   муцин.   Так   как   концентрация   белков   в   слюне   слишком   мала   при высокой удельной их активности и оказывается ниже пороговой чувствительности химического теста на белок, в проведенных качественных цветных реакциях на белок, исключая ксантопротеиновую, нами получен отрицательный результат.  Мы   выяснили,   что   ферменты,   в   том   числе   и   амилаза,     играют   важную   роль   в жизнедеятельности организмов. Немаловажную роль играют они и в проведении многих   технологических   процессов.   Они   используются,   например,   в   процессах приготовления   пищи,   в   производстве   пищевых   продуктов   и   напитков, фармацевтических препаратов, моющих средств, текстиля, кожи и бумаги. [3] Роль ферментов в жизнедеятельности организмов можно проиллюстрировать Схемой 6. [1]:  30 Врожденные  нарушения  Врожденные  нарушения  обмена обмена Взаимопревра­  щение веществ Взаимопревра­  щение веществ Бактериальное  Бактериальное  брожение  брожение  Биохимическая  Биохимическая  эволюция эволюция Физиологи­  Физиологи­  ческая  регуляция ческая  регуляция Катализ Катализ Клеточный  метаболизм Клеточный  метаболизм Превращение  Превращение  энергии энергии Кинетика  реакции Кинетика  реакции Биосинтез Биосинтез Е (ферменты) Е (ферменты) Коферменты Коферменты Ультраструкту­  Ультраструкту­  ра мембраны ра мембраны Взаимодей­  Взаимодей­  ствие с  ствие с  лекарствами лекарствами Макромоле­  Макромоле­  кулы кулы Питание Питание Генетический  Генетический  аппарат аппарат Список литературы: 1. Березов Т.Г., Коровкин Б.Ф., Биологическая химия, под редакцией Дебова С.С.. – М.: Медицина, 1990, с 92­113 2. Досон Р, Элиот А, Элиот У, Джонс К. «Справочник биохимика». М, «Мир», 1991. 31 3. Габриелян   О.С.,   Остроумов   И.Г.,   Карцова   А.А.   «Органическая   химия   –   10 класс». М., «Просвещение» 2005 г 4. Габриелян О.С., Остроумов И.Г., Соловьев С.Н., Маскаев Ф.Н. «Общая химия: учеб. Для 11 кл. общеобразовательных учреждений с углубленным изучением химии». М.: «Просвещение» 2005 г 5. Артюхина А. И., «Амилаза слюны как объект научного исследования»// Химия в школе 2006. ­ №8 – 75­76с. 6. Джибладзе К.М., «Метаболизм углеводов» // Химия в школе 2005. ­ №6 – с.65 7. Мороз Н.Е., «Биохимия: Методические указания к практикуму по спецкурсу». – Калининград: Изд­во РГУ им. И. Канта, 2005. 8. Шумный В.К., Дымшиц Г.М., «Биология. Общая биология»: учебник для 10 – 11 классов: в 2 ч., ­ М.: «Просвещение, 2006. 9. Ресурсы Интернета:   o http://www.xumuk.ru/encyklopedia/199.html o http://www.  chemnet.ru o http://belok­s.narod.ru o http://chem.km.ru o http://chemistry.ssu.samara.ru o http://exsperimemt.edu.ru o http://schoolchemistry.by.ru 32 Класс ферментов Катализируемая реакция Оксидоредуктазы Перенос атомов водорода или электронов от одного  Трансферазы Гидролазы Лиазы Изомеразы Лигазы вещества к другому Перенос определенной группы атомов – метильной,  ацильной, фосфатной или аминогруппы – от одного  вещества к другому Реакции гидролиза Негидролитическое присоединение к субстрату или  отщепление от него группы атомов. При этом могут  разрываться связи C – C, C – О или C – S Внутримолекулярная перестройка Соединение двух молекул в результате образования  новых связей C – C, C – N, C – О или C – S,  сопряженное распадом АТФ Таблица1.  Примеры ферментов  или их групп Дегидрогеназа Трансаминаза, киназа Липаза, амилаза,  пептидаза Декарбоксилаза,  фумараза, альдолаза Изомераза, мутаза Синтетаза Признаки различий Химическая природа Неорганические катализаторы Низкомолекулярные вещества, образованные одним или несколькими элементами Таблица 2 Ферменты Белки – высокомолекулярные полимеры Дисперсная система Грубодисперсные. Преобладают пена, Коллоидная система Селективность аэрозоли, эмульсии Низкая Очень высокая Оптимальное значение Сильнокислая или щелочная Небольшой физиологический интервал рН­ рН­среды Изменение структуры катализатора в ходе реакции Увеличение скорости реакции Изменяется незначительно или не Изменяется в значительной степени и изменяется вовсе В 102 – 106 раз восстанавливается в исходную структуру по окончанию реакции В 108 – 1012 раз среды Ионы двухвалентных металлов Фермент, который они активируют Таблица 3. Fe2+ Cu2+ Mo2+ Co2+ Ca2+ Каталаза, пероксидаза Аскорбактаксидаза, тирозиназа Нитроредуктаза, альдегидоксидаза Некоторые пептидазы Амилаза, липаза 33 Zn2+ Mg2+ Mn2+ Карбоангидраза, карбосипептидаза Фосфотаза, пируваткарбоксилаза Аргиназа, фосфорглюкомутаза Таблица 4. Фермент Пепсин Амилаза из солода Амилаза слюны Каталаза Уреаза Липаза панкреатическая Трипсин Аргиназа рН 1,5­2,5 4,9­5,2 6,8­7,0 6,8­7,0 7,0­7,2 7,0­8,5 7,5­8,5 9,5­10,0 1 2 3 4 5 6 7 8 Таблица5 10 9 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 Желтый Желтый Желтый Сиреневый Сиренев ый Светло­  синий Синий Синий  Ярко­ синий Темно­ синий Время от начала гидролиза, мин Крахмал + амилаза Крахмал + HCl 0 2 4 + ­ ­ + + + Таблица 6 «+» ­  положительная  проба  крахмала  на йод; «­»­  отрицательная  йодная проба на  Номер  пробирки Разведение  слюны Цвет раствора  I2 № 1. 2. 3. крахмал. Субстрат 1.Крахмал 2.Крахмал 3.Крахмал Фермент Кипяченая амилаза Амилаза Амилаза Температура 37­40°С 37­40°С 0 °С 37­40°С Таблица7 Реакция на йод + ­ + ­ Таблица8 Субстрат 1. Крахмал 2. Крахмал 3. Крахмал Среда HCl Н2О NaOH Фермент Амилаза Амилаза Амилаза Проба на йод ­ + + 34 «+» ­ положительная проба на йод; «­» ­ отрицательная йодная проба № пробы Субстра т Фермент Проба на йод 1 2 3 Крахмал Амилаза + NaCl Крахмал Амилаза + CuSO4 Крахмал Амилаза + Н2О ­ + ­ «+» ­ положительная проба  крахмала на йод; «­» ­ отрицательная йодная проба на крахмал. Таблица9 Таблица 10: Время 0 30 сек 1мин 1,30 2 230 3 3,30 4 4,30 5 5,30 6 6,30 7 7,30 8 8,30 9 9,30 10 10,30 11 Цвет Т.­синий Т.­синий Т.­синий Т.­синий Т.­синий Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый Красно­коричневый коричневый коричневый коричневый коричневый светло­коричневый светло­коричневый Темно­желтый Темно­желтыйо Желтый Желтый Желтый Желтый Продукт гидролиза Крахмал Аилодекстрин Аилодекстрин Аилодекстрин Аилодекстрин Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Эритродекстрины Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтодекстрин Мальтоза Мальтоза Мальтоза Мальтоза Глюкоза Глюкоза Глюкоза Глюкоза Таблица11 № пробирки α ­амилиза Йодная проба цвет β ­амилаза Йодная проба цвет 1 2 3 4 5 6 7 ­ ­ ­ + кремовый Розово­сиреневый красный синий + + + 35 Темно­синий, очень  Темно­синий  Более синий 8 9 10 «+» ­ положительная проба крахмала  на йод; «­» ­ отрицательная йодная проба на крахмал. Светло­синий Темно­синий + + + синий Таблица 12. Субстра т Крахмал Амилаза Сахароза Амилаза Фермент Реакция с йодом Реакция с реактивом Феллинга ­ ­ Появление   кирпично­ красного осадка Изменений не произошло «+» ­ положительная проба на йод; «­» ­ отрицательная йодная проба Фото1  36 Фото 2 Фото 3 Фото 4 Фото5. 4 Пробирка 1 2 0 Пробирка 2 37 38 39