Эфирные масла жимолости

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ  РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ЭФИРНЫЕ МАСЛА ЖИМОЛОСТИ Методические рекомендации Алматы 2014 УДК 581.19: 602.3:633/635 ББК 42.14  Э94 Рецензенты:  Сарсенбаев Б.А. – доктор биологических наук, профессор Нестерова С.Г. – доктор биологических наук, профессор Казахского Национального Университета им. Аль­Фараби Авторы: С.В. Кушнаренко, Т. Озек, Г. Озек, Л.Н. Карашолакова,  Г.А. Утегенова, К.Т. Абидкулова. С.В.Кушнаренко и др. Э94      Эфирные масла жимолости: Методические рекомендации. / – С.В. Кушнаренко, Т. Озек, Г. Озек и др. Алматы, 2014. – 29 с. ISBN 978­601­7343­03­3  Изложены   основные   принципы  проведения  работ   по  получению эфирных масел из различных частей растений. Приведены рекомендации по сбору, высушиванию и сортировке растительного материала, правила работы на аппарате Клевенджера, по определению качественного состава и   количественного  содержания  компонентов,  а   также   по   выявлению антимикробной активности эфирных масел. Методические рекомендации предназначены для преподавателей и студентов высших учебных заведений, магистрантов, PhD­докторантов и специалистов   в   области   биотехнологии  растений  и  химии   природных соединений.   УДК 581.19: 602.3:633/635 ББК 42.14 2 ISBN 978­601­7343­03­3  © Институт биологии  биотехнологии растений © С.В.Кушнаренко и др., 2014 СОДЕРЖАНИЕ НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ .......................................................... ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ …………………………..... ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………….. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТ …………. Оборудование …………………………………………………….. Материалы, инструменты и реактивы ………………………….. Лабораторная посуда …………………………………………….. СБОР И ВЫСУШИВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА  Сбор растительного материала ....................................................... Высушивание растительного материала ....................................... ЭКСТРАКЦИЯ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ МЕТОДОМ  ГИДРОДИСТИЛЛЯЦИИ ................................................................ Чистка флаконов и пастеровских пипеток .................................... ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ВЫХОДА ЭФИРНЫХ МАСЕЛ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ …………. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ЭФИРНЫХ  МАСЕЛ ................................................................................................... АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ …….. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ………………. 4 5 6 8 8 9 9 9 9 11 12 20 21 22 24 27 1. 1.1. 1.2. 1.3. 2. 2.1. 2.2. 3. 3.1.  4. 5. 6. 3 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ ГОСТ   6.38­90   Унифицированные   системы   документации.   Система организационно­распределительной документации. Требования к оформлению документов. ГОСТ 2.105­95 Единая система конструкторской документации. Общие требования к текстовым документам.  ГОСТ   7.1­2003   Библиографическая   запись.   Библиографическое описание. Общие требования и правила составления.  ГОСТ 7.32­2001 Отчет о научно­исследовательской работе. Структура и правила оформления. ГОСТ Р. 52905­2007 (ИСО 15190:2003) Лаборатории исследовательские. Требования к безопасности.  ГОСТ 2261­94 Средства измерения электрических и магнитных величин. Общие технические условия.  ГОСТ 25336­82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. 4 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ БАВ – биологически активные вещества ЭМ – эфирное масло GC­FID  –  gas   chromatography   with   flame   ionization   detector   –   газовая хроматография с плазменно­ионизационным детектором  GC/MS – gas chromatography mass spectrometry – газовая хроматография с масс­спектрометрией NIST  – National Institute of Standards and Technology  – Национальный Институт Стандартов и Технологии  х.ч. – химически чистый 5 ВВЕДЕНИЕ В последние годы в мире возрос интерес к изучению жимолости как источнику биологически  активных  веществ  (БАВ). В этом  направлении проводятся   исследования   в   Китае,   Японии,   Корее,   Турции   и   странах Евросоюза.   Так,   китайскими   учеными   проведен   качественный   и количественный   анализ   эфирных   масел   и   экстрактов   некоторых   видов жимолости (Lonicera  fulvotomentosa  P.S.  Hsu  &  S.C.  Cheng,  L.  japonica Thunb.,  L.  macranthoides  Hand.­Mazz.). Выявлено около 140 БАВ, в том числе  флавоноиды,   органические   кислоты   и   другие   соединения, обладающие широким спектром фармакологического действия, включая и антибактериальную,  антиоксидантную     антивирусную, гепатопротекторную активности [Shang et al., 2011; Huang et al., 2011; Sun et al., 2011; Jurikova et al., 2012]. Род  Lonicera  (сем.  Caprifoliacea)   содержит   около   200   видов.   В Казахстане   произрастает   21  вид   жимолости.   Среди   них   пищевое   и лекарственное значение имеют жимолость илийская (L.  iliensis  Pojark.) и жимолость   алтайская   (L.  altaica  Pall.)   [Джангалиев   и   др.,   2001; Дикорастущие   полезные   растения   Казахстана,   2008;   Куклина,   2004]. Плоды   жимолости   богаты   витаминами,   углеводами   и   фенольными соединениями.   Они   издавна   используются   в   народной   медицине, благотворно   воздействуют   на   сердечно­сосудистую   систему,   обладают противовоспалительным,   мочегонным,   желчегонным   и   антиязвенным действием   [Артамонов,   1989].   Однако   с   точки   зрения   возможности использования в официальной медицине казахстанские виды жимолости все   еще   не   изучены.   Прежде   всего,   это   касается   исследования содержащихся в их составе БАВ.  6 Жимолость   илийская   занесена   в   Красную   Книгу   Казахстана   как редкий, почти эндемичный вид с резко уменьшающимся ареалом [Красная книга Казахской ССР, 1981].  В отличие от жимолости илийской и алтайской, плоды жимолости татарской   несъедобны,   в   дикорастущем   виде   этот   вид   встречается   в предгорьях   Тянь­Шаня   и   Алтая.   Жимолость   татарская   благодаря быстрому   росту   и   неприхотливости   часто   выращивается   в   качестве декоративного кустарника.  Из 200 видов рода Lonicera наиболее изученным видом с точки зрения фитохимии   является   жимолость   японская   (Lonicera  japonica  Thunb). Выявлен   широкий   спектр   действия   летучих   компонентов, экстрагированных из цветков жимолости японской. Так, была показана их значительная цитотоксичная активность на клеточных линиях рака мозга U251 и рака легких  Hepg2 [El­Kashoury  et  al., 2007]. Выявлен высокий антимикробный потенциал эфирного масла Lonicera japonica в отношении ряда   патогенов,   развивающихся   при   хранении   в   продуктах   питания,   а именно   против   штаммов  Bacillus  subtilis,  Salmonella  enteritidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и др., что позволяет рекомендовать эфирное   масло   и   экстракты,   полученные   из   жимолости   японской,   в качестве консервантов для использования в пищевой и фармацевтической промышленности  [Rahman  et  al.,   2009].   Эфирные   масла   многих   видов растений   обладают   высокой   антимикробной   активностью   [Bajpai  et  al., 2013;  Murakami  et  al.,   2013;   Tadtong et   al.,   2014].   Некоторые   авторы связывают   антимикробную   активность   растительных   экстрактов   с флавоноидами и терпенами [Nostro et al., 2000]. К сожалению, сведений о биологической активности эфирных масел, выделенных из казахстанских видов жимолости, в литературе не имеется.  7 В   настоящих   методических   рекомендациях   изложены   основные принципы проведения работ по получению эфирных масел из различных частей   растений   на   примере   трех   видов   жимолости.   Приведены рекомендации   по   сбору,   высушиванию   и   сортировке   растительного материала,   правила   работы   на   аппарате   Клевенджера,   по   определению качественного   состава   и   количественного   содержания   компонентов,   а также по выявлению антимикробной активности эфирных масел. 1. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТ Для   правильного   проведения   работ   лаборатория   должна   быть оснащена   соответствующим   оборудованием,   лабораторной   посудой, химическими   реактивами,   а   также   необходимо   иметь   помещение   для высушивания растительного материала.  1.1. Оборудование Для экстракции  эфирного масла из воздушно­сухого растительного сырья   методом   гидродистилляции  необходимы  аппарат   Клевенджера  с круглодонной стеклянной колбой объемом 1000 или 2000 мл (рисунок 1, А) и колбонагреватель (рисунок 1, Б). Для изучения качественного состава и количественного содержания компонентов эфирного масла используется газовый   хроматограф   с   плазменно­ионизационным   (GC­FID)   и   масс­ спектрометрическим   детекторами   (GC/MS)    Масс­ (рисунок   2). спектрометрия проводится  на колонках  HP­Innowax FSC. Для сравнения образцов при масс­спектрометрии используются стандартные вещества, а также базы данных Wiley GC/MS Library (Wiley, New York, NY, USA), MassFinder software 4.0 [Hochmuth, 2008], Adams Library [Adams, 2007] и NIST   Library.   Холодильник   (+4°С)   и   морозильная   камера   (­18­20°С) 8 необходимы   для   хранения   образцов   эфирных   масел.   Баллон   с газообразным азотом, оснащенный редуктором, используется для удаления остатков   гексана   из   эфирных   масел   (рисунок   3).   Сухожаровой   шкаф, вытяжной   шкаф,   весы   лабораторные.   Так   как   при   гидродистилляции используется дистиллированная вода также нужно иметь дистиллятор. 1.2. Материалы, инструменты и реактивы Пастеровские   пипетки  стеклянные   с   дозатором   (рисунок   4,   А), тефлоновые   камешки,   фольга,   парафильм,   секатор   для   измельчения растительного материала, фарфоровые чашки со ступками, крафт­бумага. Комплект   стандартов   –   насыщенных   алканов   (С7­С40),   в концентрации   1000   мкг/мл   каждый   для   идентификации   компонентов эфирных   масел.   Органический  растворитель   гексан,   х.ч.  (≥97,0%)  для улавливания летучих веществ.  Сульфат натрия безводный  (Na2SO4), х.ч., используется  в   качестве  обезвоживающего   средства   для   удаления остатков воды из эфирных масел. Спирт этиловый для обработки аппарата Клевенджера.  1.3. Лабораторная посуда  Химические   стаканы   объемом  500­1000   мл;   воронки;   стеклянные палочки; емкости для хранения растворов и сыпучих реактивов; флаконы объемом 1­5 мл для сбора эфирных масел; хроматографические флаконы из   темного   стекла   объемом   1,5   мл,   с   крышками,   укомплектованными PTFE/Si  мембранами,  для хранения образцов эфирных масел  (рисунок 4, Б).   Колбы   с   притертыми   пробками   для   органических   растворителей   – гексана и спирта.  9 2. СБОР И ВЫСУШИВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА  2.1. Сбор растительного материала Эфирные   масла   накапливаются   во   всех  частях  растения:   листьях, цветках,   почках,   плодах  и  корнях.  Фазы  вегетации  и  сроки  сбора растительного материала  определенно влияют на  качественный  состав и количественное   содержание  компонентов,   а   также   на   выход   эфирного масла. В связи с этим, очень важно соблюдать правила и сроки сбора. Однако фазы вегетации  даже одного вида могут быть  вариабельны  из­за метеорологических условий данного года, водного режима, высоты над уровнем   моря  и   географического   положения  популяций.   Часто  цветки лучше   собирать   в   первой   половине   дня,   желательно   утром.   Так   как, содержание летучих компонентов, когда их аромат наиболее интенсивен, наивысшее в это время суток.  Растительный   материал   собирается   и   высушивается   согласно требованиям   Государственной   Фармакопеи   (в   проветриваемом помещении,   не   допускается   прямое   попадание   солнечных   лучей   во избежание   потери   летучих   веществ).   Хранится   материал   после высушивания   исключительно   в   бумажных   пакетах   из   крафт­бумаги.  Не допускается сбор растительного материала в пакеты из газет или бумаги с типографской краской, а также в полиэтиленовые пакеты во избежание контаминации   растительного   материала.   Не   рекомендуется   собирать сырье около трассы, промышленных производств (заводы, фабрики, и т.д.), поскольку в таких местах возможно накопление и загрязнения тяжелыми металлами и поллютантами (загрязняющими веществами).  Для   каждого   собранного   вида   растения   необходимо   создать гербарный   образец,   что   является   обязательным   требованием   при публикации в зарубежном журнале с импакт­фактором. 10 Нами был собран растительный материал 3 видов жимолости  (сем. Caprifoliacea):  Lonicera   iliensis  Pojark.,  Lonicera   altaica  Pall.   ex   DC   и Lonicera tatarica L. Растительный материал (цветки, листья и плоды) был собран из различных популяций на стадии массового цветения и стадии плодоношения   (рисунок   5,   6).   Образцы   гербарного   материала   каждого собранного вида жимолости хранятся в Гербарии Института биологии и биотехнологии растений.  Сбор   образцов   жимолости   проводился   согласно   методике рендомизированного отбора. Описание образцов проводили с указанием географических   координат   точки   сбора   (широта,   долгота,   высота   над уровнем   моря),   определяемых   с   помощью   GPS­навигатора   ETREX (Garmin); морфологическое описание образцов: высота кустарника; форма кроны; размер, форма, цвет и вкус плодов; форма цветков и листьев.   2.1. Высушивание растительного материала  Содержание влаги зависит от вида, местообитания и органа растения. Собранный   материал   следует   сушить   в   хорошо   проветриваемых помещениях, в тени без попадания прямых солнечных лучей (рисунок 7). При такой сушке сохраняется  естественная окраска стеблей, листьев и цветков.   Поскольку   в   плодах   содержание   воды   больше,   они   сушатся дольше (3­4 нед) по сравнению с другими частями растений (1­1,5 нед – цветки,   листья,   стебли).   Время   от   времени   необходимо   перемешивать сырье для обеспечения равномерного высушивания всего растительного материала и предотвращения порчи нижних слоев. Высушенный   растительный   материал   хранится   в   помещениях   с хорошей   вентиляцией   в   бумажных   пакетах.   На   пакетах   должны   быть приклеены   этикетки   с   указанием   наименования   вида   растения,   номера 11 образца,   типа   растительного   материала,   даты   и   места   сбора,   фамилии сотрудника, собравшего материал. 3. ЭКСТРАКЦИЯ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ МЕТОДОМ ГИДРОДИСТИЛЛЯЦИИ Для экстракции эфирных масел рекомендуется использовать аппарат Клевенджера (рисунок 8) [European Pharmacopoeia, 2005]. Экстракцию эфирных масел можно разделить на 3 этапа:  1 этап – Предварительная чистка аппарата Клевенджера и подготовка его к работе. Колба   должна   быть   чистой.   В   колбу   объемом   2   л   налить   1   л дистиллированной   воды.   Чтобы   вода   кипела   равномерно  добавить тефлоновые камешки (5­6 шт.). Высушить салфеткой дно колбы. Подсоединить аппарат Клевенджера к колбе. Закрыть все выходные отверстия   алюминиевой   фольгой.   Выход   пара   должен   осуществляться только через кончик сливного носика. Под носиком должен стоять стакан для сбора капель воды.  Вода для охлаждения холодильника должна быть выключена. Проводить кипячение дистиллированной воды в течение 1­1,5 час. Проверить чистоту установки по отсутствию запаха. При наличии запаха кипячение продолжить еще 1 час. 12 Промыть трехходовой кран хозяйственным мылом. Он должен быть чистым, без запаха, затем обработать этиловым спиртом.  2 этап – Дистилляция В сухую чистую колбу загрузить растительный материал (30­60 г). При   загрузке   растительный   материал   не   должен   касаться   горловины колбы. Количество загружаемого растительного материала зависит от его плотности   и   объема.   Например,   высушенные   плоды,   как   правило, занимают небольшой объем, и в 2­х литровую колбу, можно загрузить от 40   до   100   г   растительного   сырья.  Для   получения   эфирного   масла   из листьев и цветков, загружается  от 20 до 35 г растительного материала. Оптимально, чтобы объем растительного материала занимал не более ½ объема колбы.  Добавить   дистиллированную   воду   с   осторожностью,   чтобы   не образовалась   накипь.   Количество   воды   должно   превышать   объем растительного материала, как минимум, в 10 раз. Оптимальный уровень жидкости   в   колбе   –   не   более   ½   объема   колбы.   Если   растительный материал   требует  измельчения,  его  следует  проводить  непосредственно перед   загрузкой   во   избежание   потерь   летучих   компонентов.   Если растительный материал (ветви, трава, кора, корни) крупный, его следует измельчить   секатором   на   части   размером   1­1,5   см.   Нужно   учитывать наличие сапонинов в некоторых видах растений, что может привести к вспениванию! В этом случае загружать меньшее количество материала и следить за процессом дистилляции, регулируя температуру.  Подсоединить   колбу   с   растительным   материалом   к   аппарату Клевенджера.   Вставить   трехходовой   кран   в   положении   ╝  (закрыто). Подсоединить   охлаждение,   включив   проточную   холодную   воду. Проверить напор воды. Добавить дистиллированной воды в Клевенджер. Проверить воронки для воды и гексана, они должны быть открыты. 13 Включить   колбонагреватель.   Дождаться   появления   первых   капель эфирного   масла.   Засечь   время.   В   среднем,   длительность   процесса дистилляции составляет 3 часа. Если растение содержит много эфирного масла, то время дистилляции можно увеличить до 4 час.  Во время дистилляции следить, чтобы кипячение было равномерным и  не   очень   сильным.  Проверять   степень   охлаждения   прошедшего   через холодильник эфирного масла. Если охлаждение недостаточное, следует увеличить напор воды и уменьшить степень нагрева. В противном случае возможна потеря летучих веществ. Если   количество   эфирного   масла   незначительное,   то   для удерживания его необходимо добавить небольшое количество гексана (1 мл) в качестве ловушки.  5 А 6 Б Рисунок 1 – Оборудование для экстракции эфирных масел:  А – Схема аппарата Клевенджера: 1 – трехходовой кран; 2 – шкала мензурки; 3 – холодильник; 4 – круглодонная колба с шлифованной горловиной; 5 – воронка для добавления воды; 6 – воронка для добавления растворителя (гексана); Б – Колбонагреватель 14 Рисунок 2 – Газовый хроматограф «Agilent 5975 GC­MSD system»  с пламенно­ ионизационным детектором и масс­спектрометрией Рисунок 3 – Баллон, оснащенный редуктором, с газообразным азотом для удаления остатков гексана из эфирных масел А 15 Б Рисунок 4 – Материалы для экстракции эфирных масел: А – Стеклянная пастеровская пипетка и дозатор; Б – Флаконы из темного стекла для хроматографического анализа и хранения образцов эфирных масел объемом 1,5 мл, с крышками. 16 Рисунок 5 – Природные популяции Lonicera iliensis Pojark. (№1, №2, №3), Lonicera altaica Pall. ex DC (№4) и Lonicera tatarica L. (№5­6).  Стрелками (№1­№6) указаны места сбора растительного материала.      Б     Г Б Рисунок 6 – Популяции жимолости:  А В А А – Жимолость илийская: Б – Плоды жимолости илийской; В – Жимолость татарская; Г – Цветки жимолости татарской В 17 Г Рисунок 7 – Сушка собранного растительного материала:  А, Б – листья и цветки жимолости татарской; В, Г – листья и цветки жимолости алтайской Рисунок 8 – Экстракция эфирных масел методом гидродистилляции с использованием аппарата Клевенджера 18 Рисунок 9 – Образцы эфирных масел в хроматографических флаконах, герметично закрытых парафильмом A b u n d a n c e 3 4 0 0 0 0 3 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 8 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 6 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 T im e - - > T I C : G S 2 7 3 A . D \ d a ta . m s 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 0 6 0 . 0 0 6 5 . 0 0 7 0 . 0 0 7 5 . 0 0 Рисунок 10 – Хроматограмма компонентов эфирного масла из листьев  жимолости алтайской 19 А       Б        В Рисунок 11 – Ингибирование роста колоний Bacillus cereus под воздействием эфирных масел жимолости.  А – контроли: стандартные антибиотики тетрациклин, стрептомицин и растворители гексан и этиловый спирт (96%); Б­В – эфирные масла жимолости  3 этап – Отбор пробы эфирного масла  По истечении 3 час выключить колбонагреватель.  Подготовить чистый стеклянный флакон для сбора эфирного масла. Через 5­10 мин начать сбор эфирного масла, для этого медленно открыть   кран   на   выход   в   положении   ╚  (открыто).   Довести   уровень эфирного масла до нулевой отметки шкалы мензурки и сделать подсчет количества эфирного масла в мл. Открыть   кран   и   продолжить   спуск   эфирного   масла.   Собрать эфирное масло в стеклянный флакон, стараясь избежать попадания в него воды.  Провести удаление остатков воды из эфирного масла, насыпав во флакон   с   эфирным   маслом   безводный   сульфат   натрия   (на   кончике скальпеля). При помощи пастеровской пипетки перенести эфирное масло в   заранее   взвешенный   хроматографический   флакон   из   темного   стекла. Закрыть   завинчивающейся   крышкой   и   дополнительно   парафильмом 20 (рисунок 9). Хранить до последующего анализа в холодильнике при +4°С, при длительном хранении – в морозильнике при ­18­20°С.  3.1. Чистка флаконов и пастеровских пипеток  Для   чистки   флаконов   и   пастеровских   пипеток   необходим   слабый водный раствор средства для мытья посуды. После промывания пипеток и флаконов   в   этом   растворе,   следует   тщательно   ополоснуть   проточной водой и затем дистиллированной водой. Далее флаконы и пастеровские пипетки помещают в стакан с дистиллированной водой и кипятят 40­45 минут на электрической плитке. После кипячения пастеровские пипетки и флаконы сушат в сушильном шкафу при температуре 170ºС в течение 30 мин.  4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ВЫХОДА ЭФИРНЫХ МАСЕЛ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Количественное содержание эфирных масел вычисляют  в объемно­ весовых   процентах   в   расчете   на   воздушно­сухую   массу   растительного материала.  Если   в   полученном   эфирном   масле   присутствует   гексан, сначала его надо удалить, используя баллон с газообразным азотом. Гексан удаляют под слабой струей газообразного азота. Пример   расчета   количественного   выхода   эфирных   масел   из воздушно­сухого растительного сырья: Масса растительного материала для экстракции ЭМ 1 40 г Масса пустого флакона 2 2,240 г 2,607 г 21 Масса Масса Количественный флакона с полученного выход ЭМ ЭМ 3 ЭМ 4 0,367 5 0,9175% Масса ЭМ = (Масса флакона с ЭМ) – (Масса флакона) = 0,367 г Т.е. из 40 г воздушно­сухого сырья получено 0,367 г эфирного масла. Для   определения   количественного   выхода   нужно   пересчитать   массу эфирного масла на 100 г. растительного материала: 40 г ­­­­­­­­­­ 0,367 г. ЭМ 100 г ­­­­­­­­ х Х= 0,918% Таким   образом,   в   приведенном   примере   количественный   выход эфирного масла равен 0,92%.  Согласно литературным данным выход эфирного масла, выделенного из свежих цветков  Lonicera japonica  варьировал от 0,31 до 0,58%, а для образцов  Lonicera caprifolium  от  0,16 до 0,23% [Ilie  et al., 2014], выход ṣ эфирного   масла,   полученного   из   воздушно­сухих   цветков  Lonicera japonica,   составлял   0,43%   [Rahman,   Kang,   2009].   В   литературе   также имеются   сведения   о   том,   что  выход   эфирного   масла   выделенного   из воздушно­сухих бутонов жимолости японской составлял 0,07% [Zhou  et al., 2012]. По   литературным   данным   известно,   что   виды   растений   семейства Pinaceae (Сосновые) характеризуются наибольшим содержанием летучих веществ.   Так,   отмечается   высокий   выход   эфирных   масел   из   сосны сибирской   –  в   побегах  Pinus   sibirica,  произрастающей   в   Красноярском крае, содержание эфирных масел составляло 3,42% от абсолютно сухого сырья [Нарчуганов и др., 2011].  5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ЭФИРНЫХ МАСЕЛ Для определения качественного состава и количественного содержания компонентов эфирных масел используется метод газовой хроматографии. Газовая   хроматография   –   метод   разделения   сложных   смесей   и   летучих 22 веществ, а также способ получения отдельных веществ в чистом виде. В роли подвижной фазы выступает водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ.  Принцип   разделения   компонентов   исследуемого   образца   основан   на различиях   в   летучести   и   растворимости   компонентов   разделяемого эфирного масла.  Разделенные   вещества   выходят   из   колонки   и   регистрируются детектором.   Сигнал   детектора   записывается   в   виде   хроматограммы   и автоматически   фиксируется.   По   расположению   и   форме   пиков   в хроматограмме можно анализировать характеристики веществ.  Для исследований такого плана используется газовый хроматограф с   и   масс­спектрометрическим плазменно­ионизационным   детекторами (GC/MS).  Масс­спектрометрия  проводится  на колонках  HP­ (GC­FID) Innowax FSC.  Детекторы непрерывно измеряют концентрации веществ на выходе   из   хроматографической   колонки.   Принцип   действия   детектора основан   на   измерении   такого   свойства   исследуемого   компонента   или вещества, который не свойственен подвижной фазе.  Для   определения   компонентов   необходимо   иметь   стандартные вещества, а также базы данных Wiley GC/MS Library (Wiley, New York, NY, USA), MassFinder software 4., Adams Library [Adams, 2007] и NIST Library. Эти стандарты также прогоняются, как и исследуемые образцы эфирного   масла.   По   времени   удержания   (retention   time)  пиков   в хроматограмме,   а   также   по   данным   масс­спектрометрии   проводится идентификация компонентов.  Эфирные   масла  представляют   собой   сложный   комплекс   различных летучих   органических   соединений.   В   состав   эфирных   масел   входят терпены и терпеноиды, предельные и непредельные углеводороды, спирты, альдегиды,   органические   кислоты   и   их   сложные   эфиры,   а   также гетероциклические соединения и др.  23 Так, например, в эфирном масле, полученном из листьев жимолости алтайской  на   стадии   плодоношения,  методом   газовой   хроматографии идентифицировано 18 компонентов с содержанием более 1% (рисунок 10, таблицы 1, 2).  Таблица 1 – Классы химических соединений в эфирном масле,  полученном из листьев жимолости алтайской на стадии плодоношения № п.п. Классы химических соединений в ЭМ, 1 2 3 4 5 6 7 8 полученном из листьев жимолости алтайской Альдегиды  Жирные кислоты Полициклические ароматические  углеводороды Кетоны Спирты  Монотерпеноиды Фенилпропаноиды Нор­каротиноид ВСЕГО: % 28,5 16,0 10,2 6,5 4,8 4,3 1,2 1,1 72,6 Таблица   2   –   Компоненты   эфирного   масла   из   листьев   жимолости алтайской на стадии плодоношения № п.п. Компоненты* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (Z)­3­Гексеналь Линалоол Октанол ­Циклоцитраль ­2,5­Епокси­6,8­мегастигмадиен Нафтален (E)­Геранил ацетон 1­Метил нафтален 2­Метил нафтален Тетрадеканаль (E)­­Ионон Пентадеканаль 3,4­Диметил­5­пентилиден­2(5H)­фуранон Додекановая кислота (=Лауриновая кислота) 1­Эйкозанол 24 % 11,3 2,7 3,2 1,2 1,1 4,3 1,6 3,6 2,3 1,4 4,1 14,6 2,4 2,8 1,6 16 17 18 Фитол Тетрадекановая кислота Гексадекановая кислота (=Пальмитиновая  кислота) ВСЕГО: Примечание – * В таблице указаны компоненты с содержанием ≥ 1% 1,2 3,0 10,2 72,6 Обнаружено высокое содержание альдегидов (28,5%), жирных кислот (16,0%) и полициклических ароматических углеводородов (10,2%). Кроме того, в состав этого образца эфирного масла входят кетоны (6,5%), спирты (4,8%), монотерпеноиды (4,3%), фенилпропаниод (1,2%) и нор­каротиноид (1,1%). 6. АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ С   увеличением   резистентности   микроорганизмов   к   антибиотикам,   а также   насекомых   к   инсектицидам,   возникает   интерес   к   изучению биологической активности природных соединений. Например, известно, что эфирные масла обладают широким спектром биологической активности, в том   числе   антимикробным   действием.   Следовательно   эфирные   масла   и экстракты можно использовать для борьбы с инфекцией или для сохранения пищи.   Таким   образом   масла   и   растительные   экстракты   являются перспективными   природными   антимикробными   агентами   в   пищевой   и фармацевтической промышленности [Rahman et al., 2014].  Эфирные   масла   –   многокомпонентные   летучие   вещества.  По литературным   данным   основные   составляющие   компоненты   эфирных масел, такие как монотерпены, сесквитерпены, и их кислородсодержащие производные ответственны за антимикробную активность  [Rahman  et  al., 2009].   Например,   терпеноиды   были   эффективны   против  Listeria monocytogenes L. [Aureli et al., 1992; Cowan, 1999]. 25 Также   изучен   противогрибковый   потенциал   эфирных   масел   и спиртового   экстракта   из   листьев  Lonicera   japonica  Thunb.   Результаты показали, что эфирные масла  и экстракты  L.  japonica  Thunb. могут быть потенциальными источниками природных фунгицидов для защиты человека и животных от грибковых инфекций [Rahman et al., 2014].  Эфирное   масло   выделенное   из  Hypericum  rumeliacum  имело высокую   активность   в   отношении  Escherichia   coli,  в   то   время   как Enterobacter   cloaceae  были   наиболее   устойчивы.   По   мнению   авторов, антибактериальные свойства эфирного масла  H. rumeliacum  могут быть связаны с высоким содержанием в нем монотерпенов α­пинена и ß­пинена [Guedes et al., 2012].  Кислородсодержащие монотерпены (монотерпеноиды), такие как 1,8­ цинеол,   камфора   и   терпинен­4­ол   также   обладали   антимикробной активностью   [Pattnaik   et   al.,   1997]   и   были   активны   в   отношении   грибов (Candida, Cryptococcus) [Zuzarte et al., 2011].  Антимикробное действие эфирных масел в основном объясняют С10 и   С15   терпенами   с   ароматическими   кольцами   и   фенольными гидроксильными группами, способных образовывать водородные связи с активными   центрами   ферментов­мишеней,   хотя   и   другие   активные терпены,   а   также   спирты,   альдегиды   и   сложные   эфиры   могут   вносить вклад   в   общий   антимикробный   эффект   эфирных   масел  [Belletti  et  al., 2004].   Сильную   антибактериальную   активность   проявили   следующие компонены   эфирных   масел:  α­пинен   и  ß­пинен,   лимонен   и   линалоол [Magiatis et al., 1999].  Определение антимикробного действия эфирных масел проводят по общепринятой   методике  –  диск­диффузионным   методом  [Murray  et  al., 1995].   Бумажный   диск   стандартных   размеров   (0,5   см),   пропитанный 26 эфирным маслом в разных количествах (5­20 мкл), накладывают на посев микроорганизмов в питательной среде в чашках Петри (рисунок 11). Для   тестирования   были   использованы   следующие   штаммы микроорганизмов: грамположительные бактерии  Bacillus cereus,  Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus 10, грамотрицательный штамм Escherichia  Антимикробную   активность   оценивают   путем   измерения coli  113. диаметра зоны ингибирования против проверенных патогенов. В результате проведенного исследования выявлено, что выраженную антимикробную   активность   как   к   грамотрицательным,   так   и   к грамположительным   бактериям   показали   несколько   образцов   эфирного масла  L. altaica  и  L. iliensis.  Антимикробную активность против всех 4 микроорганизмов   показало   эфирное   масло  L.   iliensis  (популяция   на   р. Чарын),   выделенное   из   листьев   на   стадии   цветения.   Так,   этот   образец эфирного масла был эффективен против штамма Staphylococcus aureus 10, при   этом   его   активность   не   отличалась   от   стандартного   антибиотика тетрациклина и была достоверно выше, чем антибиотик стрептомицин. 27 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Артамонов   В.И.   Редкие   и   исчезающие   растения   (По   страницам Красной книги СССР). – М.: Агропромиздат, 1989. – 383 с. 2. Джангалиев А.Д., Салова Т.Н., Туреханова Р.М. Дикие плодовые растения Казахстана. – Алматы, 2001. – 135 с. 3. Дикорастущие   полезные   растения   Казахстана.   –   Алматы:   Асыл кiтап, 2008. – 100 с. 4. Куклина   А.Г.   Анализ   изменчивости   жимолости   илийской (Lonicera iliensis Pojark.) в природе и интродукционной популяции // Бюл. Гл. ботан. сада. 2004. – Вып. 187. – С. 38­43. 5. Красная книга Казахской ССР. Часть 2. Растения. – Алма­Ата. 1981. – 284 с. 6. Нарчуганов   А.Н.,   Струкова   Е.Г.,   Ефремов   А.А.   Компонентный состав   эфирного   масла   сосны   сибирской   (Pinus   sibirica)   //   Химия растительного сырья. – 2011. – № 4. – С. 103­108. 7.   Adams,   R.P.   Identification   of   Essential   Oil   Components   by   Gas Chromatography / Mass Spectrometry.  –  Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL. – 2007.  8.  Aureli P, Costantini A, Zolea S. Antimicrobial activity of some plant essential oils against Listeria monocytogenes // J. Food Prot. – 1992. – V. 55. – P. 344–348. 9. Bajpai   V.K.,  Shukla  S., Sharma A.  Essential  oils  as  antimicrobial agents // Natural Products. – 2013. – P. 3975­3988. 10.   Belletti N., Ndagihimana M., Sisto C., Guerzoni M., Lanciotti R., Gardini   F.   Evaluation   of   the   antimicrobial   activity   of   Citrus   essences   on Saccharomyces cerevisae // J. Agric. Food Chem. – 2004. – V. 52. – P. 6932­6938.   Cowan   M.M.   Plant   products   as   antimicrobial   agents  //  Clin. 11. Microbiol. Rev. – 1999. – V. 12. – P. 564–82. 12. El­Kashoury  E.A.,  Khaleel  A.E.,  Mousa   O.M.,  Daoud   M.H.  Anti­ cancer   volatile   constituents   from   the   flowers   of  Lonicera   japonica  Thunb. cultivated in Egypt // Egypt. J. Biomed. Sci. – 2007. – V. 23. – P. 130­141.  28 13. European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg, France. – 2005. 14.   Guedes   A.P.,   Gregory   F.,  Fernandes­Ferreirа  M.  Hypericum  sp.: Essential oil composition and biological activities  // Photochemistry Reviews. – 2012. – V. 11 (1). – P. 127­152. 15.   Huang L, Wang D, Chen X. Study on constituents of essential oil from  Lonicera fulvotomentosa  in different collected periods // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. – 2011. – V. 36 (16). – P. 2230­2232. 16.   Ilies  D.,   Raduleskcu   V.,   Dutu   L.   Volatile   constituents   from   the flowers   of   two   species   of   honeysuckle   (Lonicera   japonica  and  Lonicera caprifolium) // Farmacia. – 2014. –V. 62. –P. 194­201. 17. Jurikova   T.,   Rop   O.,   Mlcek   J.,   Sochor   J.,   Balla   S.,   Szekeres   L., Hegedusova   A.,   Hubalek   J.,   Adam   V.,   Kizek   R.   Phenolic   profile   of   edible honeysuckle berries (genus Lonicera) and their biological effects // Molecules. – 2012. – V. 17. – P. 61­79.  18.   Magiatis   P.,   Melliou   E.,   Skaltsounis   A.,   Chinou   J.B.,   Mitakus. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Pistacia lentiscus Var. Chia. // Planta Medica. – 1999. – V. 65(8). – P. 749­752. 19.  Murakami C., Lago J.H.G., Perazzo F.F., Ferreira K.S., Lima M.E.L., Moreno P.R.H., Young M.C.M. Chemical composition and antimicrobial activity of   essential   oils   from  Chromolaena   laevigata  during   flowering   and   fruiting stages // Chemistry & Biodiversity. – 2013. – P. 621­627. 20. Murray   P.R.,   Baron  E.J.,  Pfaller  M.A.,   Tenover  F.C.,  Yolke   R.H. Manual of clinical microbiology (6 th ed.). Washington: ASM. – 1995. 21.  Nostro A., Germano M.P., D’Angelo V., Marino A., Cannatelli M.A. Extraction   methods   and   bioautography   for   evaluation   of   medicinal   plant antimicrobial activity // Lett. Appl. Microbiol. – 2000. – V. 30. – P. 379­384.  22.   Pattnaik S., Subramanyam V.R., Bapaji M., Kole C.R. Antibacterial activity of aromatic constituents of essential oils // Microbios. – 1997. – V. 89. – P. 39­46. 29 23. Rahman   A.,   Kang   S.C.  In   vitro  control   of   food­borne   and   food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thumb. // Food Chemistry. – 2009. – V. 116. – P. 670­675. 24. Rahman   A.,   Al­Reza   S.   M.,   Siddiqui   S.   A.,   Chang   T.   K.,   Sun   C. Antifungal potential of essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb. against dermatophytes // Ezcli. Journal. – 2014. – Vol. 13. – P. 427­436.  25.  Shang X, Pan H, Li M, Miao X, Ding H. Lonicera japonica Thunb.: Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine // J. Ethnopharmacol. – 2011. – V. 138 (1). – P. 1­21.  26.  Sun M.Y., Feng X., Lin X.H., Yin M., Zhao X.Z., Chen Y., Shan Y. Studies   on   the   chemical   constituents   from   stems   and   leaves   of  Lonicera macranthoides // Zhong Yao Cai. – 2011. – V. 34 (2). – P. 218­220. 27.  Tadtong S., Watthanachaiyingcharoen R., Kamkaen N. Antimicrobial constituents and synergism effect of the essential oils from Cymbopogon citratus and Alpinia galanga // Nat. Prod. Commun. – 2014. – V.9. – No. 2. – P. 277­280. 28.   Zhou H.Y., Zhao N.N., Shan S.D.,  Yang K., Wang C.F., Liu Z.L., Qiao Y.J. Insecticidal activity of the essential oil of Lonicera japonica flower buds and its main constituent compounds against two grain storage insects // Journal of Medicinal Plants Research. – 2012. – V. 6 (5). – Р. 912­917.  29. Zuzarte M., Gonçalves M. J., Cavaleiro C., Canhoto J., Vale­Silva L., João Silva M., Pinto E., Salgueiro L. Chemical composition and antifungal activity of the essential oils of Lavandula viridis L’He´ r // J. Med. Microbiol. – 2011. – V. 60. – P. 612­618. 30 31