МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА НА ТЕМУ: «ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ»

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА НА ТЕМУ:  «ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ» Цель:  исследовать   активность   каталазы,   ускоряющей   разложение токсичной для организма перекиси водорода до свободного кислорода и воды. Р е а к т и в ы  и  о б о р у д о в а н и е: 3%­ные растворы медного купороса (CuSO4) и  нитрата свинца (Pb(NO3)2) или  ацетата  свинца  (купить  в  аптеке «свинцовую   примочку»);     3%­ный   раствор   перекиси   водорода   (H2O2); половинка   клубня   картофеля;   пипетки,   градуированные   на   1   и   5   мл; фарфоровая ступка с пестиком; медный цилиндр и специальный стакан; весы с разновесами, колбы на 50 мл, скальпель, мел, секундомер. Х о д  р а б о т ы: Каталаза, относящаяся к классу оксидоредуктаз, содержится в животных и растительных тканях и включает железо в составе геминовой простетической группы.   Фермент   проявляет   высокую   активность:   одна   молекула   каталазы разлагает до 5 млн молекул перекиси водорода в минуту при 0 єС. Максимальная активность фермента обнаруживается в интервале от 0 є до 10 єС. Оптимальное значение pH действия лежит в пределах 6,0–8,0 единиц. Активность   каталазы   в   исследовательской   работе   измеряется манометрическим методом, который основан на измерении объема кислорода, выделившегося   при   воздействии   фермента   на   субстрат.   Измерить ферментативную   активность   можно   с  помощью   специального   прибора   (см. рис. 1). Зажим необходим для установления (в открытом положении) уровня жидкости   в   бюретке   на   нулевой   отметке.   При   отсутствии   стандартного каталазника   его   можно   заменить   на   самодельный,   изготовленный   из   двух центрифужных   пробирок   (1)   или   обыкновенных   стеклянных   трубок диаметром до 15 мм, нижние концы которых соединяются резиновой трубкой и зажимом (2), а верхние через тройник (3) соединяются резиновой трубкой с измерительной   бюреткой.   Бюретку   следует   заполнить   2%­ным   раствором серной кислоты, чтобы предотвратить гнилостные процессы в воде и снизить в ней   растворение   газа.   Избыток   раствора,   образующийся   при   выделении кислорода, собирается в воронке (емкость для жидкости). Получение ферментной вытяжки каталазы из картофеля. Приготовить   навеску   1   г   очищенного   клубня   картофеля   и   тщательно растереть   в   охлажденной   льдом   ступке,   добавить   0,3   г   мела   и   5–10   мл охлажденной   воды.   Затем   полученный   гомогенат   ткани   разбавить охлажденной   водой   из   расчета   30–50   мл   на   1   г   картофеля.   Полученный раствор (ферментную вытяжку) после отстаивания слить для отделения от растительных   остатков,   измерить   объем   в   мерной   посуде   и   хранить   в стеклянном стаканчике или колбе на холоде. Измерение активности каталазы. Исследование влияния ионов свинца и меди на активность каталазы. В   одно   колено   каталазника   поместить   3   мл   ферментной   вытяжки,   а   в другое   3   мл   раствора   перекиси   водорода   (субстрата).   Присоединить каталазник   к   прибору,   установить   нулевую   точку   жидкости   в   бюретке. Быстро слить и перемешать растворы в одном из колен каталазника и через определенное   время   (через   каждую   минуту   или   5   мин)   отмечать   объем кислорода,   который   выделяется   в   процессе   ферментативной   реакции. Активность фермента выразить в объеме кислорода (мл), выделившегося за 1 мин, в расчете на 1 г сырой растительной ткани по формуле: А  объем )мл(О 2 время (  )мин общий  объем объем . ферм . ферм пробы вытяжки )мл3( )мл( Добавить в одно из колен каталазника 0,5 мл того или иного ингибитора (ацетат   свинца,   сульфат   меди)   непосредственно   перед   перемешиванием перечисленных выше растворов (опытные пробы). Ферментативную активность нужно сравнивать с контрольными пробами, в которые вместо растворов солей­ингибиторов добавляется 0,5 мл воды, чтобы общие объемы проб контроля и опыта были одинаковыми. Таким   образом,   данное   исследование   поможет   количественно проанализировать и сравнить токсический эффект ионов свинца и меди на уровне   общей   ферментативной   активности,   выявить   динамику   воздействия токсикантов на фоне нормальной кривой активности фермента во времени, определить концентрацию токсикантов, оказывающую угнетающее действие на   активность   фермента.   Наконец,   получение   достаточного   количества повторностей   (химических   или   биологических   –   не   менее   трех)   дает возможность статистически оценить достоверность полученных результатов и различий   между   воздействием   каждого   из   токсикантов   по   сравнению   с контролем и между собой.