Research methods in cytology

ZHETYSU STATE UNIVERSITY NAMED AFTER ILYAS ZHANSUGUROV                                                                                                 ESSAY                                  Topic: Research methods in cytology                                                                              Performed: Tleukhanova M.                                                                                                   TALDYKORGAN, 2019 Plan: 1. What studies Cytology. 2. The idea that organisms are made up of cells. 3. Research methods used in Cytology. 4. Cell fractionation. 5. Autoradiography. 6. Determination of the duration of some stages of the cell cycle by radioautography. Cytology is the science of the cell. It stood out from other biological Sciences almost 100 years ago. For the first time generalized information about the structure of cells were collected in the   book   Zh.­B.   Karnua   "cell   Biology",   published   in   1884.   Modern   Cytology   studies   the structure of cells, their functioning as elementary living systems: the functions of individual cell components,   the   processes   of   cell   reproduction,   their   repair,   adaptation   to   environmental conditions and many other processes that allow us to judge the General properties and functions of all cells. Cytology also considers the features of the structure of specialized cells. In other words, modern  Cytology is the  physiology of the  cell. Cytology  is closely  associated  with scientific and methodological achievements of biochemistry, Biophysics, molecular biology and genetics. This was the basis for an in­depth study of cells from the standpoint of these Sciences and the emergence of a kind of synthetic science about the cell – cell biology, or cell biology. Currently, the terms Cytology and cell biology are the same, as their subject of study is the cell with its own laws of organization and functioning. The discipline "cell Biology" refers to the fundamental sections of biology, because it explores and describes the only unit of all life on Earth – the cell.                      A long and close study of the cell as such led to the formulation of an important theoretical   generalization   of   General   biological   significance,   namely   the   emergence   of   cell theory. In the XVII century. Robert Hooke, a physicist and biologist, characterized by great ingenuity, created a microscope. Looking at a thin slice of cork under his microscope, Hooke found that it was built of tiny, empty cells separated by thin walls, which, as we now know, consist of cellulose. He called these little cells cells cells. Later, when other biologists began to examine plant tissues under a microscope, it turned out that the small cells found by Hooke in a dead dried­up tube, there are also living plant tissues, but they are not empty, and each contain a small gelatinous body. After microscopic examination of animal tissues, it was found that they also consist of small gelatinous bodies, but that these bodies are only rarely separated from each other by walls. As a result of all these studies in 1939 Schleiden and Schwann independently formulated the cellular theory that cells are the elementary units from which all plants and all animals are ultimately built. For some time, the double meaning of the word cage still caused some misunderstanding, but then he firmly entrenched these small jelly­like bodies. Modern   understanding   of   the   cell   is   closely   related   to   technical   achievements   and improvements in research methods. In addition to conventional light microscopy, which has not lost its role, polarization, ultraviolet, fluorescence, phase­contrast microscopy has become very important   in   the   last   few   decades.   Among   them,   a   special   place   is   occupied   by   electron microscopy, the resolution of which allowed to penetrate and study the submicroscopic and molecular structure of the cell. Modern research methods have allowed to reveal a detailed picture of the cellular organization. Each cell consists of a nucleus and cytoplasm, separated from each other and from the environment   shells.   The   components   of   the   cytoplasm   are:   shell,   hyaloplasm,   endoplasmic reticulum   and   ribosomes,   Golgi   apparatus,   lysosomes,   mitochondria,   inclusions,   cell   center, specialized organelles. Part of the body that performs some special function is called an organ. Any organ – lung, liver, kidney, for example – has its own special structure, through which it plays a role in the body. Similarly, in the cytoplasm, there are special structures, a kind of structure which gives them the ability to carry certain functions necessary for cell metabolism; these structures are called organelles ("small bodies"). Clarification of the nature, function and distribution of cytoplasmic organelles became possible only after the development of methods of modern cell biology. Most useful in this respect were: 1) electron microscopy; 2) fractionation of cells by which biochemists can identify a relatively pure fraction of cells contain certain organelles, and to study, thus separate they are interested in metabolic reactions; 3) radioautography that has made possible the direct study of individual metabolic reactions that occur in organelles.                          The method by which organelles are isolated from cells is called fractionation.  This method was very fruitful, giving biochemists the opportunity to allocate different cell organelles in  a relatively  pure  form.  It allows, in  addition,  to  determine  the  chemical  composition  of organelles and enzymes contained in them and on the basis of the data to draw conclusions about their functions in the cell. As a first step, cells are destroyed by homogenization in some suitable medium, which ensures the safety of organelles and prevents their aggregation. Very often, a sucrose solution is used for this. Although mitochondria and many other cellular organelles remain intact, membrane interlacing, such as the endoplasmic reticulum, as well as the plasma membrane, disintegrate into fragments. However, the resulting fragments of membranes are often closed to themselves, resulting in rounded bubbles of different sizes. At the next stage, the cell homogenate is subjected to a series of centrifugations, the speed and duration of which increases each time; this process is called differential centrifugation. Different   cell   organelles   are   deposited   at   the   bottom   of   centrifuge   tubes   at   different centrifugation rates, depending on the size, density and shape of the organelles. The resulting sediment can be selected and investigated. Faster all deposited such large and dense structures as the core, and for the deposition of smaller and less dense structures, such as vesicles of the endoplasmic reticulum, required more speed and longer time. Therefore, at low centrifugation rates, nuclei are deposited and other cell organelles remain in suspension. At higher speeds, mitochondria and lysosomes are deposited, and with prolonged centrifugation and very high speeds, even small particles such as ribosomes precipitate. Precipitation can be examined using an electron microscope to determine the purity of the obtained fractions. All fractions are to some   extent   contaminated   with   other   organelles.   If   nevertheless   it   is   possible   to   achieve sufficient purity of the fractions, they are then subjected to biochemical analysis to determine the chemical composition and enzymatic activity of the isolated organelles. Relatively recently, another method of cell fractionation was created – centrifugation in a density gradient; while centrifugation is produced in a test tube, in which sucrose solutions are pre­layered   on   each   other   with   increasing   concentration,   and   consequently   with   increasing density.   When   centrifuging,   the   organelles   contained   in   the   homogenate   are   located   in   a centrifuge tube at the levels at which the sucrose solutions corresponding to them in density are located. This method allows biochemists to separate organelles of the same size but different density (Fig.                         Radioautography is a relatively new method that has immensely expanded the possibilities of both light and electron microscopy. This is a highly modern method, due to the development of nuclear physics, which made it possible to obtain radioactive isotopes of various elements. Radioautography requires, in particular, isotopes of those elements that are used by the cell or can bind to substances used by the cell, and which can be administered to animals or added to cultures in quantities that do not violate normal cell metabolism. Since a radioactive isotope (or a substance labeled with it) participates in biochemical reactions in the same way as its non­radioactive counterpart, and at the same time emits radiation, the path of isotopes in the body   can   be   traced   by   various   methods   of   detecting   radioactivity.   One   way   of   detecting radioactivity   is   based   on   its   ability   to   act   on   the   film   like   light;   but   radioactive   radiation penetrates the black paper used to protect the film from light, and has the same effect on the film as light.  To preparations intended for the study using light or electron microscopes, it was possible to detect radiation emitted by radioactive isotopes, drugs are covered in a dark room special emulsion, and then left for a while in the dark. Then the drugs are shown (also in the dark) and fixed. Areas of the drug containing radioactive isotopes affect the emulsion lying above them, in which   dark   "grains"appear   under   the   action   of   the   emitted   radiation.   Thus,   receive   radio autographs (from Greek. radio – xiphoid, autos – himself and graph – write).   Initially, histologists had only a few radioactive isotopes; for example, many early studies using radioautography used radioactive phosphorus. Later, much more of these isotopes were used; the radioactive isotope of hydrogen, tritium, was particularly widely used. Radioautography had and still has a very wide application for the study of where and how in the body are certain biochemical reactions. Chemical compounds labeled with radioactive isotopes that are used to study biological processes are called precursors. Precursors are usually substances similar to those that the body receives from food; they serve as building blocks for building tissues and are incorporated into complex components of cells and tissues in the same way as unlabeled building blocks are incorporated   into   them.   The   component   of   the   tissue   in   which   the   labeled   precursor   is incorporated and which emits radiation is called the product. Cells, grown in culture, although they belong to the same type at any given time will be at different stages of the cell cycle, if you do not take special measures to synchronize their cycles. However, by introducing tritium­thymidine into the cells and then producing radio autographs, the duration of the different stages of the cycle can be determined. The time of onset of one stage – mitosis – can be determined without labeled thymidine. To do this, a sample of cells from the culture is kept under observation in a phase­contrast microscope, which makes it possible to directly monitor the course of mitosis and set its terms. The duration of mitosis is usually equal to 1 h, although in some types of cells it takes up to 1.5 h. Determination of the duration of G 2­period. To determine the duration of the G 2–period, a method known as a pulse mark is used: labeled thymidine is added to the cell culture, and after a short time, the culture medium is replaced with a fresh one, in order to prevent further absorption of labeled thymidine by the cells. In this case, the label is included only in those cells that during a short stay in the medium with tritium­thymidine were in the S­period of the cell cycle. The proportion of such cells is small and only a small part of the cells will be labeled. In addition, all cells, including the label, will be in interphase – from cells, barely entered the S­period, to those, that almost finished it during the action of tritium­thymidine. In the sample taken immediately after the removal of labeled thymidine, the label is contained only in the interphase nuclei belonging to cells that were in the S­period during the exposure to the label; the same cells that were in the mitotic state during this period remain unmarked. If you then continue to take samples from the culture at regular intervals and produce a radio­autograph for each successive sample, the moment will come when the label begins to appear in the mitotic d­chromosomes. Labels will be included in all those cells that were in the S­period during the presence of tritium­thymidine in the medium, and among these cells there will be both just entered the S­period and almost finished it. It is obvious that these latter are the first among the labeled cells will do mitosis and, therefore, in their mitotic chromosomes found label. Thus, the interval between 1) the time when the labeled thymidine was removed from the culture, and 2) the time of appearance of labeled mitotic chromosomes will correspond to the duration of G 2–period of the cell cycle. Determination of the duration of the S­period. Since the cells at the time of introduction of the label into the medium at the very end of the S­period, the first to enter the mitosis, therefore, in those cells, in which the S­period begins immediately before the removal of the label, labeled mitotic chromosomes will appear in the last place. Therefore, if we were able to determine the period of time between the entry into mitosis of cells that are marked first, and the cell marked with the latter, we would set the duration of the S­period. However, although the time when the first labeled mitotic chromosomes appear is easy to establish, the time of entry into the mitosis of the cells marked by the latter can not be determined   (this   is   prevented   by   a   very   large   number   of   labeled   dividing   cells   in   the   last samples). Therefore, the duration of the S­period has to be determined in another way. In the  study  of radioautographs  of consecutive  cell  samples  taken  at  the  same  time intervals, it is found that the proportion of cells carrying the label in their mitotic chromosomes, gradually increases until labeled will not be literally all dividing cells. However, as the cells one by one complete mitosis, they develop into labeled interphase cells. The first to complete mitosis are those of the labeled cells that entered it first; and, accordingly, from cells with labeled mitotic chromosomes, the last to complete mitosis are those that entered it later than anyone. Since the duration of mitosis is always the same, therefore, if we could determine промежуток между: 1) временем  окончания  митоза  в  клетках,  включивших  метку  первыми,  и  2)  временем  включивших  метку  последними, окончания  митоза  в  клетках,  мы  установили  бы продолжительность  S­периода.  Продолжительность   S­периода   нетрудно   установить, определив промежуток между: 1) моментом времени, когда 50% митотических клеток в культуре несут метку, и 2) моментом времени, после которого культура уже не содержит 50% меченых клеток.  Determination of generation time (total duration of the whole cell cycle). Continuing to select from the culture of cell samples, you can find that the labeled mitotic figures at some point completely disappear, and then reappear. Such dividing cells are daughter cells deriving from those stem cells that have incorporated the label while in the moment of impact of tritium­thymidine incorporation in S­period. These mother cells went into the S­ period, separated, and then went through the second interphase and the second division, that is, did one complete cycle and part of the next. The time required to complete the cell cycle is called the generation time. It corresponds to the interval between two consecutive peaks of the label inclusion and usually corresponds to the interval between those points of successive upward curves in which 50% of mitotic figures contain the label.     Literature. A. ham, D. Cormack "Histology", volume 1 Moscow "WORLD" 1982; M. Abramov "Clinical Cytology" Moscow "MEDICINE", 1974; Yu. S. Chentsov "General Cytology»