Витамины А и D.

   Тема: Получение β-каротина (провитамин А) и витамина D2     План:   1. Характеристика и получение β-каротина (провитамин А).

             2. Характеристика и получение витамина D₂ . Ключевые слова:  каротины,  кальциферол.

   Витамины – низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в клетке в малых количествах и обладающие биологической активностью. Биологическая активность витаминов определяется тем, что они входят в состав активных центров ферментов в качестве кофакторов.  Поэтому недостаток витаминов понижает биокаталитическую активность ферментов, влияет на обменные процессы, рост и развитие организма.  Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.  Все водорастворимые и жирорастворимый витамин К являются коферментами биохимических реакций. Витамины А, D, Е участвуют в регуляции генетического аппарата клетки.  Потребность взрослого организма в витаминах (в зависимости от вида) составляет от нескольких мкг до десятков мг в сутки.  Водорастворимые  витамины в организме не накапливаются, кроме В₁₂ , поэтому необходимо их ежедневное поступление. Жирорастворимые витамины накапливаются в тканях (это индукторы синтеза белков, структурные компоненты клеточных мембран).

   В естественных условиях биосинтез витаминов осуществляют растения и микроорганизмы. Однако, при обработке растительной пищи наблюдается потеря витаминов, к примеру, при получении муки  высшего сорта теряется 80-90% витаминов.          Витамин А - циклический, непредельный одноатомный спирт, образуемый в слизистой кишечника и печени из провитаминов: α-, β-, γ-каротинов под воздействием фермента каротиноксидазы. Наибольшей активностью обладает β-каротин, так как образует две молекулы ретинола; другие -  только одну.  Каротиноиды - широко распространенная группа природных пигментов, образуемых высшими растениями, водорослями и некоторыми микроорганизмами. В организме человека и животных каротины не образуются.  Основные источники β-каротина  для животных – растительные корма, человек получает  β-каротин также  из продуктов животного происхождения.  β-Каротин можно получить  из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны.        В начале 60-х годов  ХХ века разработана схема микробиологического синтеза βкаротина, которая стала основой  промышленного способа его получения.  Среди микроорганизмов β-каротин синтезируют  фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи.  При этом, содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание  этого провитамина у растений.  Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы мицелиального  гриба  Blakeslea trispora – 3-8 тыс.мкг.   

   Микробиологический синтез основан на использовании  Blakeslea trispora, в качестве субстрата применяется пшеничная или рисовая мука, растительное масло (хлопковое, кукурузное или подсолнечное).  Вносятся стимуляторы синтеза  β-каротина В-ионон или цитрусовая меласса,  тиамин, а также  свет, обладающий стимулирующим эффектом.

   Вначале (+) женские и (-) мужские штаммы мицелия  выращивают раздельно.   Затем их смешивают в биореакторе, непосредственно перед ферментацией. Соотношение (+) и (-) штаммов должно быть 1/15, т.е. мужские штаммы должны преобладать в 15 раз. При слиянии разнополого женского (+) и мужского (-) мицелия образуется зигота, которая синтезирует в 5-17 раз больше бета-каротина, чем каждый штамм в отдельности. Ферментация сопровождается аэрацией и перемешиванием. Длительность ферментации - 6-7 дней.    Накопление бета-каротина наблюдается  во второй фазе развития, после прекращения роста мицелия. В культуральной среде уменьшается концентрация липидов вследствие их активной переработки в бета-каротин. Концентрация бета-каротина достигает 2000мг/л.

   По окончании ферментации биомасса сепарируется, подвергается распылительной сушке до 7% остаточной влаги. Далее в зависимости от назначения, цели применения используются различные технологии:

-                     если необходим в качестве кормового концентрата – после сушки порошок смешивается с наполнителем и гранулируется;

-                     для применения в качестве пищевой добавки – экстрагируется маслом, концентрируется, промывается этанолом. В результате получают каротин  в масле  (подсолнечное или другое)  с содержанием  2,0-2,5 г/кг провитамина.  Используется  как пищевая добавка к хлебу, маслу;

-                     для медицинских целей – экстрагируют фреоном, очищают от органических примесей и получают кристаллы оранжево-красного цвета.  Выпускается в капсулах для приема через рот.  

     Витамин D (кальциферол)

   Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Различают два родственных соединения жирорастворимого витамина   D – D₂  и D_{3 .}  D₂  - эргокальциферол (кальциферол - в переводе «несущий кальций») получают путем облучения эргостерина ультрафиолетовыми лучами.  

D₃  - холекальциферол образуется из 7-дегидрохолестерина.  В организме человека и животных кальциферол регулирует усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани.    

    В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФоблучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5-10% эргостерина.

   В качестве промышленного источника эргостерина используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вследствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования происходит накопление в клетках дрожжей сквалена (предшественника эргостерина). Индукция синтеза эргостерина начинается при строго определенной концентрации кислорода от 0,03 до 2%. При этом среда должна содержать избыток углеводов и малое количество азота. По окончании процесса спиртового брожения дрожжи отделяют от барды и вносят в питательную среду необходимое количество источников углерода, азота и фосфора. Ферментацию ведут в аэробных условиях 12 -- 20 часов, по окончании которой клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости, добавляют антиоксиданты и сушат. Обычно в такой биомассе содержание эргостерина достигает 1,5%.  Полученную биомассу гидролизуют раствором соляной кислоты, затем очищают спиртом, концентрируют и облучают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 280-300 нм. Это излучение возбуждает отдельные химические связи в углеродных циклах и вызывает превращение эргостерина в  витамин D₂ . 

   Для получения масляной формы витамин после фильтрации растворяют в растительном масле и используют как пищевую добавку. 

   Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи подвергают  кислотному гидролизу при 110⁰ С. Витамин D₂  экстрагируют спиртом, фильтруют, фильтрат упаривают  и несколько раз промывают спиртом. Спиртовой экстракт сгущают до 50%-й концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Образовавшиеся кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире, отгоняя последний. Кристаллический осадок растворяют в масле . Препарат используют  в медицинских целях.  Эргостерин служит также исходным продуктом для получения ряда стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.

            Использованная литература:

1.      Медицинская биотехнология.  К.Х.Алмагамбетов.  // Астана. – 2009. – 236с.

2.      Молекулярная биотехнология. Б. Глик,  Дж.Пастернак. // Москва «Мир». – 2002. – 589с.

3.      Биотехнология. Н.В.Загоскина, Л.В.Назаренко и др. //  Москва. – «Оникс». – 2009. – 496с.

4.      Основы биотехнологии.  Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина.  //  Москва. –

«Академия». – 2008. – 208с.

5.      Биотехнология микроорганизмов. Алмагамбетов К.Х.  // Астана. – 2008. – 244с. 

     Контрольные вопросы:

1.        Характеристика витаминов 

2.        Характеристика витамина А.

3.        Характеристика витамина   D₂ .

4.        Характеристика микроорганизмов, синтезирующих витамины.

5.        Микробиологический синтез β-каротина.

6.        Микробиологический синтез эргостерина.

7.        Характеристика способов очистки при микробиологическом синтезе.

8.        Использование витаминов А и  D₂  в медицине.

9.        Использование витаминов А и  D₂  животноводстве.

10.    Использование витаминов А и  D₂  пищевой промышленности.