Ферменты: строение, свойства, функции

Лекция . Ферменты: строение, свойства, функции.

План лекции:

1. Общая характеристика ферментов.

2. Строение ферментов.

3. Механизм ферментативного катализа.

4. Свойства ферментов.

5. Номенклатура ферментов.

6. Классификация ферментов.

7. изоферменты

8. Кинетика ферментативных реакций.

9. Единицы измерения ферментативной активности

1. Общая характеристика ферментов.

   В нормальных физиологических условиях биохимические реакции в организме протекают с высокими скоростями, что обеспечивается биологическими катализаторами белковой природы – ферментами.

Их изучением занимается наука энзимология – наука об энзимах (ферментах), специфических белках – катализаторах, синтезируемых любой живой клеткой  и активирующих различные биохимические реакции, протекающие в организме. Некоторые клетки могут содержать до 1000 различных ферментов.

2. Строение ферментов.

   Ферменты – это белки с высокой молекулярной массой. Как всякие белки, ферменты имеют первичный, вторичный, третичный и четвертичный уровни организации молекул. Первичная структура представляет собой последовательное соединение аминокислот и обусловлена наследственными особенностями организма, именно она в значительной степени характеризует индивидуальные свойства ферментов.  Вторичная структура ферментов организованна в виде альфа – спирали. Третичная структура имеет вид глобулы и участвует в формировании активного  и других центров. Многие ферменты имеют четвертичную структуру и представляют собой объединение нескольких субъединиц,  каждая из которых характеризуется тремя уровнями организации молекул различающихся друг от друга, как в качественном, так и в количественном соотношении.

Если ферменты представлены простыми белками, т. е. состоят только из аминокислот, их называют  простыми ферментами. К простым ферментам относят пепсин, амилазу, липазу (практически все ферменты ЖКТ).

Сложные ферменты состоят из белковой и небелковой частей. Белковая часть фермента называется  - апоферментом, небелковая – коферментом. Кофермент с апоферментом образуют холофермент. Кофермент может соединятся с белковой частью или только на время реакции, или связываться друг с другом постоянной прочной связью (тогда небелковая часть называется – простетической группой). В любом случае небелковые компоненты принимают непосредственное участие в химических реакциях путем взаимодействия с субстратом. Коферменты могут быть представлены:

• Нуклеозидтрифосфатами.
• Минеральными веществами (цинк, медь, магний).
• Активными формами витаминов (В₁ входит в состав фермента – декарбоксилазу, В₂ – входит в дегидрогеназу, В₆ – входит в трансферазы).

Основные функции коферментов:

• Участие в акте катализа.
• Осуществление контакта между ферментом и субстратом.
• Стабилизация апофермента.

Апофермент, в свою очередь усиливает каталитическую активность небелковой части и определяет специфичность действия ферментов.

В каждом ферменте выделяют несколько функциональных центров.

Активный центр – зона молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом. Активный центр представлен функциональными группами нескольких остатков аминокислот, именно в нем происходит присоединение и химическое превращение субстрата.

Аллостерический центр  или регуляторный – это зона фермента ответственная за присоединение активаторов и ингибиторов. Данный центр участвует в регуляции активности фермента.

Эти центры находятся на разных участках молекулы фермента.

3. Механизм ферментативного катализа.

   Катализ – это процесс ускорения химической реакции под влиянием катализаторов, которые активно участвуют в ней, но к концу реакции остаются химически неизмененными.  Катализатор ускоряет установление химического равновесия  между исходными веществами и продуктами реакции. Энергия, необходимая для начала химической реакции, называется энергией активации. Она необходима, чтобы молекулы, участвующие в реакции, могли перейти в реакционно-способное (активное) состояние. Механизм действия фермента направлен на то, чтобы понизить энергию активации. Это достигается разделением реакции на отдельные шаги или этапы благодаря участию самого фермента. Каждый новый этап обладает более низкой энергией активации. Разделение реакции на этапы становится возможным благодаря образованию комплекса фермента с исходными веществами, так называемыми субстратами (S). Такой комплекс называется фермент-субстратным (ES). Далее этой комплекс расщепляется с образованием продукта реакции (Р) и неизмененного фермента (Е).

E + S         ES      E + P

   Таким образом, фермент – это биокатализатор, который путем образования фермент – субстратного комплекса разбивает реакцию на отельные этапы    с более низкой энергией активации и тем самым резко повышает скорость реакции.

4. Свойства ферментов.

1.      Все ферменты  - белковой природы.

2.      Ферменты обладают высокой молекулярной массой.

3.      Они хорошо растворимы в воде, при растворении образуют коллоидные растворы.

4.      Все ферменты  - термолабильны, т.е. оптимум  действия 35 – 45^оС

5.      По химическим свойствам являются амфотерными электролитами.

6.      Ферменты высокоспецифичны по отношению к субстратам.

7.      Ферменты для своего действия требуют строго определенного значения рН (пепсин 1.5 – 2.5).

8.      Ферменты обладают высокой каталитической активностью (ускоряют скорость реакции в 10⁶ – 10¹¹ раз).

9.      Все ферменты способны к денатурации по воздействием сильных кислот, щелочей, спиртов, солей тяжелых металлов.

   Специфичность действия ферментов:

По специфичности действия ферменты делятся на две группы: обладающие абсолютной специфичностью и с относительной специфичностью.

   Относительная специфичность наблюдается, когда фермент катализирует  реакции одного типа с более чем одним структуроподобным субстратом. Например, пепсин расщепляет все белки с животного  происхождения. Такие ферменты действуют на определенный тип химической связи, в данном случае на пептидную связь. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов.

   Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно-единственное вещество и катализирует лишь определенное превращение данного вещества. Например, сахараза расщепляет только сахарозу.

   Обратимость действия:

Некоторые ферменты могут катализировать как прямую реакцию, так и обратную. Например, лактатдегидрогеназа, фермент катализирующий окисление лактата до пирувата и восстановление пирувата до лактата.

5. Номенклатура ферментов.

   Номенклатура отражает название фермента. Существует два вида номенклатуры: тривиальная и систематическая.

Систематическая номенклатура:

Название фермента является сложным и состоит из 4 частей:

1.      Название субстрата, т. е. вещества на которое действует фермент

2.      Название типа катализируемой реакции.

3.      Название одного из продуктов реакции.

4.      К названию фермента добавляется окончание –аза.

Например, в клетках печени есть фермент, катализирующий реакцию расщепления  глюкозо – 6 - фосфат до свободной глюкозы и фосфорной кислоты. Согласно номенклатуре его название будет:

Глюкозо – 6 фосфатфосфогидролаза.

1. Субстрат – глюкозо - 6 – фосфат.
2. Продукт реакции  - фосфорная кислота.
3. Тип реакции – гидролиз.
4. Окончание – «аза».

  Тривиальная номенклатура:                                                      

За некоторыми ферментами закрепились и названия, которые им были даны в ходе их открытия  - тривиальные или рабочие. Например, пепсин, трипсин, химотрипсин.

6. Классификация ферментов.

   Ферменты по типу катализируемой реакции подразделяются на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции (ЛДГ катализирует восстановление пирувата до лактата).
2. Трансферазы – катализируют межмолекулярный перенос функциональных групп (аминотрансферазы катализируют перенос аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту).
3. Гидролазы – катализируют расщепление сложных соединений в присутствии воды (практически все ферменты ЖКТ относятся к классу гидролаз – пепсин, трипсин, амилаза, липаза).
4. Лиазы – катализируют не гидролитическое расщепление соединений с двойной связью (декарбоксилаза – фермент отщепляющий карбоксильную группу).
5. Изомеразы – катализируют реакции взаимопревращения субстратов (глюкозо-6-фосфатизомераза, катализирует превращение глюкозо-6-фосфат в фруктозо-6-6фосфат).
6. Лигазы – катализируют все реакции синтеза, сопряженное с распадом АТФ.

7.  Изоферменты.

   Изоферменты – это ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по составу, свойствам, местом локализации. Изоферменты выполняют одинаковые биологические функции, но с различной эффективностью.

Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – олигомер, состоящий из 4 протомеров одного или двух типов, обозначаемых: Н и М. ЛДГ существует в 5 изоформах, легко различающихся с помощью электрофореза:

ЛДГ-1-(4Н), локализован в мышце сердца, почках.

ЛДГ-2-(3Н1М), эритроциты, тромбоциты, сердце, почки.

ЛДГ-3-(2Н2М), в поджелудочной железе, селезенка, надпочечник.

ЛДГ-4-(1Н3М), тромбоциты, легкие.

ЛДГ-5-(4М), локализован в клетках печени, скелетной мускулатуре.

8. Кинетика ферментативных реакций.

   Кинетика изучает изменение скорости ферментативной реакции во времени в зависимости отряда факторов.

• Концентрация фермента – прямо пропорциональна скорости реакции. Чем выше концентрация фермента, тем выше скорость реакции, она будет максимальной, когда ферменты полностью свяжутся в фермент-субстратный комплекс.
• Концентрация субстрата – также прямо пропорциональна скорости ферментативной реакции. С повышение концентрации субстрата будет повышаться и скорость реакции, пока не достигнет максимальной.
• Температура – так как ферменты белковые вещества, то они чутко реагируют на изменение температуры среды, проявляя оптимальную активность в ограниченных пределах. Для ферментов это 35 –45⁰С. При температуре более 45⁰С  активность ферментов снижается, а при 70-80⁰С происходит тепловая денатурация молекулы фермента, т. е. фермент инактивируется. При температуре ниже 35⁰С происходит снижение активности фермента, но она восстанавливается при возвращении к оптимальной температуре. При повышении температуры на 10⁰С скорость реакции возрастает в 2 раза. Это происходит до определенного уровня – температурного оптимума – 45⁰С.
• рН среды – каждый фермент проявляет свою максимальную активность только при определенных значениях рН среды: пепсин – 1.5 – 2.5, трипсин – 6.8 – 7.4, гастриксин – 4.5 – 5.5. При  отклонении от оптимума рН наблюдается снижение активности фермента, а при значительных изменениях рН - происходит инактивация фермента.
• Активаторы – вещества повышающие скорость ферментативной реакции. Например, ионы хлора активируют амилазу слюны, протоны водорода – пепсин.  
• Ингибиторы – вещества способные снижать скорость реакции, путем угнетения действия ферментов. Например, ионы меди тормозят действие амилазы слюны. Процесс действия ингибитора называется  - ингибирование. Ингибирование бывает: необратимое, т. е. фермент полностью теряет свою активность, что связано с нарушением его структуры. Это вызывают сильные кислоты, щелочи, спирты, яды. Обратимое - оно происходит только в период непосредственного взаимодействия фермента и ингибитора, после удаления ингибитора активность фермента вновь возвращается. Обратимое ингибирование делится на конкурентное и неконкурентное. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание  с активным центром фермента. Поскольку конкурентный ингибитор связывается обратимо с ферментом, то при увеличении концентрации субстрата увеличивается вероятность связывания фермента и субстрата, и ингибирование таким образом можно преодолеть. Неконкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и фермент не сходны по структуре и ингибитор присоединяется к регуляторному центру фермента. В данном типе ингибирования влияние ингибитора не может быть преодолено повышением концентрации субстрата.

9. Единицы измерения ферментативной активности

   Активность – это изменение субстрата под влиянием фермента в единицу времени. 

Международная единица активности (МЕ или U) – количество фермента, катализирующие превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин. В системе СИ используют «катал», который определяется как 1 моль/с. В сравнении с международной единицей:

1МЕ = 16,67 * 10^-9 катал

Контрольные вопросы.

1. Дайте определения следующим понятиям – ферменты, энергия активации, катализ, активный центр, аллостерический центр.
2. Что положено в основу классификации ферментов?
3. Каковы основные свойства ферментов?
4. Что называют изоферментами? Примеры.
5. Перечислите основные факторы, влияющие на активность ферментов.
6. Дайте определения следующим понятиям – энзимопатии, энзимотерапия, энзимодиагностика. Приведите примеры.

Лекция 16. Использование ферментов в медицине

План лекции:

1. энзимопатии

2. энзимотерапия

3. энзимодиагностика

4. Клинико-диагностическое значение определения некоторых ферментов.

1. Энзимопатии.

   Энзимопатии – это заболевания, характеризующиеся нарушением содержания того или иного фермента в организме.

Наследственные энзимопатии – заболевания связанные с нарушением синтеза фермента, вызванного повреждением генетического аппарата клетки. Например, фенилкетонурия, в основе, которой лежит врожденный дефект фермента фенилаланин гидроксилазы: нарушено образование тирозина из фенинилаланина. Превращение фенилаланина идет по другому пути – с образованием фенилпировиноградной кислоты, фенилмолочной  и фенилуксусной кислоты, которые в большом количестве выдеяются с мочой. Дефицит тирозина тормозит биосинтез его производных – норадреналина – медиатора в нервной системе, что приводит к дальнейшему поражению головного мозга и слабоумию.

Приобретенные энзимопатии – заболевания связанные с недостаточностью витаминов и минеральных веществ (алиментарные энзимопатии) или угнетением активности фермента токсинами (токсические энзимопатии). При недостатке витаминов могут возникать нарушения, так как если тот или другой витамин не поступает с пищей, кофермент не образуется и фермент остается неактивным.

2. энзимотерапия.

   Особое место занимает использование ферментов в качестве лечебных препаратов – энзимотерапия.

Фибринолизин применяют при лечении незаживающих ран, пролежней, для рассасывания тромбов. Лидаза используется после операции для предотвращения образования грубых рубцов. Пепсин применяется при лечении нарушений пищеварения. Вобэнзим  - комплекс гидролитических ферментов (трипсин, химотрипсин, амилаза, урокиназа). Они способствуют устранению функциональных нарушений кровоснабжения, предупреждают появление атеросклероза.

3.Энзимодиагностика – использование ферментов в диагностике заболеваний. В нормальных условиях активность ферментов в сыворотке крови относительно невелика, по сравнению с их активностью в тканях. При поражениях ряда органов и тканей, что связано с нарушением проницаемости мембран клеток и выходом из них ферментов в кровяное русло, происходит увеличение их активности.

Количественно определяя нефункциональные ферменты плазмы (индикаторные ферменты), можно диагностировать заболевание. Например, при инфаркте миокарда повышается активность ферментов - АсАТ, КК, при заболеваниях костей – ЩФ.

Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях:

• Органоспецифичность.
• Низкая активность в крови в норме.
• Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа.
• Высокая стабильность в крови (не менее 1-2 часов).
• Доступная методика определения активности фермента.

Недостатки ферментативного анализа:

• Основным недостатком использования ферментов в диагностике повреждения тканей является отсутствие строгой специфичности по отношению к конкретной ткани или типу клеток.

Выход: определяют для каждого органа спектр ферментов (несколько ферментов, характерных для данной ткани: сердце-ЛДГ-1, КК-МВ, АсАТ), определяют изоферменты.

• После повреждения ткани активность внутриклеточных ферментов в плазме возрастает по мере их освобождения из поврежденных клеток, а затем снижается в результате их клиренса.

Выход: важно строго учитывать время взятия пробы относительно первичного повреждения.

4. Клинико-диагностическое значение определения некоторых ферментов.

   Липаза – фермент, принимающий участие в расщеплении жиров, поступающих в кишечник вместе с пищей. Наиболее важной для диагностики является панкреатическая липаза.

N – 0-417 МЕ/л.

Активность панкреатической липазы увеличивается в плазме крови при:

• Панкреатите любого происхождения.
• Новообразованиях поджелудочной железы.

   ГГТ – гаммаглютамилтрансфераза, фермент, принимающий участие в «строительстве» белковых молекул. Катализирует реакцию переноса глютамилового остатка на аминокислоту. В больших количествах содержится в печени, почках, поджелудочной железе, желчных ходах.

Определение ГГТ особенно важно  при диагностике малосимптомных гепатитов, а также при наблюдении за течением хронических заболеваний печени.

Биологическим материалом является сыворотка крови. N – 0.6 - 6.36 ммоль/ч*л.

Увеличение активности ГГТ наблюдается при:

·         Механической желтухе (застойная), холестазе.

·         Желче-каменной болезни.

·         Остром вирусном гепатите (активность повышается после падения активности АТ).

·         Хроническом гепатите.

·         Циррозе печени.

·         Инфаркте миокарда (по истечению 4 суток заболевания и держится 2-3 недели, вследствие усиления восстановительных процессах в мышце сердца и печени).

·         Возрастает под влиянием алкоголя (является чувствительным тестом для выявления хронического алкоголизма).

Уменьшение активности ГГТ наблюдается при:

• Декомпенсированном циррозе печени.

   ХЭ – холестераза, фермент, расщепляющий эфиры холина. ХЭ представлена двумя видами фермента:

1. ацетилхолинэстераза – участвует в проведении нервного импульса и содержится в нервной ткани, эритроцитах.
2. холинэстераза – продуцируется печенью.

Уровень активности ХЭ используется как показатель синтетической активности печени. При выраженном повреждении паренхимы печени активность ХЭ значительно уменьшается. Низкая активность фермента указывает на тяжелое течение заболевания. Нормализация активности фермента  свидетельствует об улучшении функции печени.

N – 160-340 ммоль/л*ч

Уменьшение активности ХЭ наблюдается при:

• механической желтухе, холецистите;
• желчекаменной болезни;
• циррозе печени;
• остром гепатите (значительное снижение);
• инфаркте миокарда;
• миеломе;

Увеличение активности ХЭ наблюдается при:

• тяжелых заболеваниях почек (нефриты, нефротический синдром);
• язвенной болезни желудка;
• ожирении, сахарном диабете.

   КК – креатинкиназа, фермент принимающий участие в энергетическом обмене клеток мышечной, нервной тканей. Катализируя реакцию образования и распада креатинфосфата.

Молекула КК состоит из двух субъединиц – В и М, при комбинации которых образуются три изофермента:

КК-ММ – мышечный.

КК-МВ – сердечный.

КК-ВВ – мозговой.

В плазме здорового человека КК-ММ-98%, КК-МВ-2%, а КК-ВВ отсутствует.

N – 0 – 1.2 ммоль/л*ч.

Увеличение активности КК в сыворотке  крови наблюдается:

• в раннем периоде инфаркта миокарда (в 10-30 раз через 2-3 часа);
• при поражении мышечной ткани (травме, мышечной дистрофии, тяжелой физической нагрузке);
• шизофрении, эпилепсии.

   ЛДГ – лактатдегидрогеназа, фермент катализирующий превращение молочной кислоты в пируват и наоборот. ЛДГ олигомер, состоящий из 4 субъединиц, представленных – Н и М. В плазме выявлено 5 изоферментов:

ЛДГ-1-(4Н), локализован в мышце сердца

ЛДГ-2-(3Н1М), эритроциты, тромбоциты, сердце.

ЛДГ-3-(2Н2М), в поджелудочной железе.

ЛДГ-4-(1Н3М), тромбоциты, легкие.

ЛДГ-5-(4М), локализован в клетках печени, скелетной мускулатуре.

N – 0.8 – 4.0 ммоль/л

Увеличение активности ЛДГ в сыворотке крови наблюдается при:

• инфаркте миокарда (через 12-14 часов после начала ИМ);
• недостаточности функции сердечно-сосудистой и легочной систем;
• гемолитической анемии;
• воспалительных заболеваний печени (особенно острых форм);
• повреждении мышц;