Инструктивная карточка для проведения эксперимента "Хроматографический анализ биоматериала"

Тема: ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОМАТЕРИАЛА.  ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В КОЖНЫХ СМЫВАХ Большинство   аминокислот,   которые   не   содержат   характерных функциональных групп, обнаружить специфическими цветными реакциями не удается. С   другой   стороны,   из   литературы   (П.   Гамильтон)   известно,   что   с поверхности большого пальца можно смыть более 20 разных аминокислот.  Для   определения   отдельных   аминокислот   в   кожном   смыве   можно прибегнуть   к   хроматографическому   анализу.   В   условиях   школьного   урока вполне   пригодна   по   своей   доступности   и   быстроте   так   называемая восходящая хроматография на бумаге. Для проведения опыта понадобятся: 1. Полоски качественной фильтровальной бумаги размером примерно 4  12 см. 2. Камера для хроматографии, а попросту стеклянная банка или цилиндр, в которые можно было бы подвесить полоску. 3.   Проявитель:   смесь   бутилового   спирта,   уксусной   кислоты   и   воды   в соотношении 4:1:1. 4.   0,2–0,5   %­ный   ацетоновый   или   спиртовый   раствор   нингидрина   с добавлением нескольких капель уксусной кислоты. 5. Электроплитка или сушильный шкаф для прогревания хроматограмм. Т е х н и к а  в ы п о л н е н и я  а н а л и з а. На расстоянии 1–2 см от нижнего края хроматографической полоски прочертить простым карандашом линию старта и на нее нанести образцы смывов в количестве примерно 10 мкл (размер пятна около 1 копеечной монеты). Для надежности можно аккуратно упарить   смывы   в   фарфоровой   чашечке   в   5–10   раз   и   наносить   более концентрированный образец. На линии старта помещается 2–3 образца. Далее, хроматограмму закрепляем в камере, погрузив ее нижний конец в проявитель, налитый   на   дно   камеры,  ниже   линии   старта.  Хроматографическую   камеру плотно   накрываем   стеклом,   насыщая   атмосферу   камеры   проявителем. Последний поднимается по бумажной полоске (капиллярные силы), увлекая с собой аминокислоты и другие компоненты смыва. За 30 минут проявитель поднимается почти до верхнего края полоски. Затем она вынимается, сушится и смачивается или опрыскивается раствором нингидрина, после чего снова хорошо прогревается до появления пятен вишневого цвета, соответствующих аминокислотам.Стоит   ли   подробно   описывать   эту   процедуру,  которую   проще   показать воочию?   Однако   мы   столкнулись   с   тем   фактом,   что   выпускники   наших педуниверситетов, знакомы   с   техникой хроматографического анализа на бумаге и в тонком слое.   как   правило,   мало   В связи с этим очень небольшой экскурс в историю аналитической химии. Возникновение   хроматографии   как   аналитического   метода   справедливо связывают с именем известного российского ботаника М. С. Цвета, который в начале ХХ века показал возможность разделения растительных пигментов на колонке с сорбентом (адсорбционная хроматография).  Дальнейшее   свое   развитие   хроматография   получила   через  40 лет,  когда английские   химики   А. Мартин   и   Р. Синг   разработали   технику   планарной хроматографии на фильтровальной бумаге. Благодаря своим методическим разработкам   эти   молодые   англичане   смогли   основательно   продвинуться   в области белковой химии и заработать Нобелевскую премию по химии в 1952 году.  Естественно,   много   воды   утекло   с   тех   пор   в   биохимической   науке. Появились   автоматические   аминокислотные   анализаторы,   работающие   на основе ионообменных смол. Развилась газо­жидкостная хроматография и т. п. Место   бумажной   хроматографии   отчасти   заняла   тонкослойная хроматография с более высокой разрешающей способностью. Однако все эти продвинутые методы хроматографического анализа в силу своей дороговизны, сложности и капризности оборудования недоступны не только для школ, но и для провинциальных учебных институтов. Сложная аппаратура имеет также тот недостаток, что на ней трудно понять принципы метода.   Внутрь   прибора   не   заглянешь.   Старый   «дедовский»   метод хроматографии на бумаге быстро и наглядно продемонстрирует школьникам суть и возможности хроматографического анализа, позволит понять принцип метода хроматографии.  Следует   оговориться,   что   в   предложенном   упрощенном   и   ускоренном варианте приличного разделения аминокислот в смыве получить не удается: слишком   короток   пробег   (менее   12   см),   слишком   много   разделяемых компонентов   в   смыве;   кроме   того,   обычная   фильтровальная   бумага   –   не лучший носитель для хроматографии. Впрочем, нам удалось получить до 10 отдельных   аминокислот   в   смыве,   используя   полоски   хроматографической бумаги, ватман длиной до 25 см и повторное разделение образца до 4 раз (рис.1).  В этом случае на анализ уходит несколько дней. Для модельных опытов с хорошим разделением аминокислот можно использовать смесь из двух всего аминокислот,   например,   глицина   и   валина   или   лейцина.   Такие   две аминокислоты   хорошо   разделяются   с   помощью   описанной   упрощенной процедуры (рис. 2).Рис. 1. Бумажная хроматограмма смыва с рук человека:  слева – обработка нингидрином (10 аминокислот);  справа – диазореакция Паули (снизу вверх: гистидин, тирозин, урокановая кислота) Рис. 2. Бумажная хроматограмма смеси аминокислот (валин, глицин) Для   закрепления   учебного   материала   по   хроматографическому   анализу можно предложить процедуру разделения красителей с помощью восходящей хроматографии на бумаге. Для этого на старт хроматограммы наносим не аминокислоты, а маленькие (размером с булавочную головку) капли красок фломастеров  разного  цвета   и  разгоняем   их,  как   описано  для   аминокислот (можно   использовать   другой   проявитель,   например,   спирто­водную   смесь). Для исследованных нами фломастеров получилась такая картина: красный, желтый и коричневый красители поднялись от старта на 0,5 см, зеленый на самом   деле   оказался   смесью   желтого   и   голубого   красителей,   а   синий содержал помимо синего еще и розовый компонент. Что касается черногокрасителя,  то   в  нем   обнаружены  отдельные   пятна   красного,  пурпурного   и синего пигментов. Таким   образом,   установлено,   что:   а)   хроматографическая   подвижность красителей   фломастеров   различна,   б)   некоторые   красители   состоят   из нескольких пигментов. Далее можно провести хроматографию на бумаге паст шариковых   ручек,   установив   распределение   (подвижность)   и   гомогенность красителей паст, хроматографическое разделение смеси кислотно­щелочных индикаторов, акварельных красок и т. п. Все эти опыты легко и быстро выполнимы.  Ознакомимся с принципом распределительной хроматографии на бумаге. В основе   метода   лежит   неравномерное   распределение   смеси   веществ   в   двух несмешивающихся   фазах; у  нас это  бутиловый спирт  и вода.  Волокнистая структура   фильтровальной   бумаги   хорошо   удерживает   воду   и водорастворимые   вещества,   тогда   как   несорбирующийся   бутиловый   спирт быстро движется по бумаге вверх, увлекая с собой вещества, растворимые в бутанольной   фазе.   Тогда   некое   вещество   Х,   растворимое   в   воде,   должно оставаться на линии старта, а растворимое в бутиловом спирте вещество У поднимется вместе с фронтом растворителя. Одинаково хорошо растворимое и в воде, и в бутаноле вещество Z достигнет точно середины хроматограммы. Если вычислить отношения пробега конкретного вещества к пробегу фронта проявителя,   получим   так   называемый   коэффициент   распределения   (Rf), величину,   постоянную   для   вещества   в   данной   проявляющей   смеси.   В вышеуказанном случае вещество Х будет иметь коэффициент распределения 0, вещество У – 1, а вещество Z – 0,5. Реальные вещества из смеси, например, аминокислоты  или красители, в зависимости от химического строения, частично растворяются и в воде, и в бутиловом   спирте   и   таким   образом   имеют   строго   определенные коэффициенты   распределения.   Из   входящих   в   состав   белков   аминокислот одни лучше растворяются в водной фазе и, стало быть, движутся медленно. Эти аминокислоты (лизин, аргинин, цистеин, гистидин, глицин) можно назвать гидрофильными. С другой стороны, лучше растворимые в бутанольной фазе аминокислоты   поднимаются   по   хроматограмме   высоко   и   называются гидрофобными.   К   ним   относятся,   например,   лейцин,   изолейцин,   валин, фенилаланин и др.  Можно   предложить   задание:   исходя   из   структурной   формулы   и функциональных   групп   аминокислот   (или   другого   ряда   органических соединений)   оценить   гидрофобность   и   гидрофильность   соединения   и предсказать подвижность вещества на хроматограмме. В настоящее время широко используются пластинки для тонкослойной  хроматографии (Сорбфил, Силуфол, Фиксион и др.), у которых разрешающая  способность выше, чем у бумаги, и на которых скорость разделения, какправило, выше. Однако есть некоторые недостатки у метода тонкослойной  хроматографии, а именно: пластинки более дороги, нужен пульверизатор для  опрыскивания (бумагу можно просто промокнуть в растворе нингидрина),  наконец, тонкослойные хроматограммы быстро выцветают. Бумажные же  хроматограммы смеси аминокислот можно хранить как вещественное  доказательство многие недели.