Исследовательская работа

Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение «Викуловская средняя общеобразовательная школа № 2» Исследовательская работа «Изучение  метода  выделения ДНК из биологического материала  в условиях школьной биологической лаборатории  МАОУ «Викуловская средняя общеобразовательная школа № 2»                                                                                                      Автор: обучающийся 9 класса                                                             МАОУ «Викуловская СОШ № 2»                                                             Бобров Виктор                                                              Научный руководитель:                                                             учитель биологии Арефьева Е.В. Секция 8.Биология и сельское хозяйство 1 с. Викулово 2018 Исследовательская работа «Изучение  метода  выделения ДНК из биологического материала  в условиях школьной биологической лаборатории  МАОУ «Викуловская средняя общеобразовательная школа № 2»                                     Бобров Виктор  Российская Федерация Тюменская область село Викулово МАОУ «Викуловская средняя общеобразовательная школа № « 9 класс Аннотация           ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – высокополимерное   природное соединение, содержащееся   в   ядрах   клеток,  обеспечивающее  хранение,   передачу   из   поколения   в поколение и реализацию  генетической  программы  развития и функционирования  живых организмов.      К сожалению, при изучении столь важного материала не хватает наглядности, причина тому – сложность изучаемого материала.  Научные методы, позволяющие выделять  ДНК, слишком трудны как в техническом, так и в теоретическом плане.  В условиях школьных лабораторий   невозможно   найти   нужное   оборудование   для   проведения   работы.   А   так хочется собственными глазами  увидеть ДНК! Цель:     разработка   простого   и   доступного   метода   выделения   ДНК   из   биологического материала в условиях школьной лаборатории. Задачи: 1. отработать метод выделения ДНК из клеток; 2.   показать,   что   выделение   ДНК   возможно   в   условиях   школьной   лаборатории   без использования дорогостоящих реактивов и оборудования. 2 Содержание Введение………………………………………………………………… с. 4. Глава 1. Теоретическая часть…………………………............................с. 6. Глава 2. Практическая часть…………………………………………… с.  9. Выводы и заключение………………………………………………….. с. 12 Список литературы……………………………………………………...с.  13 3 Актуальность Введение           Что   представляет   собой   ДНК?   ДНК   (дезоксирибонуклеиновая   кислота)   – высокополимерное  природное соединение, содержащееся в ядрах клеток, обеспечивающее хранение,   передачу   из   поколения   в   поколение   и   реализацию  генетической  программы развития и функционирования живых организмов.  Рис.1. Молекула ДНК          Впервые   ДНК   была   выделена   из   лейкоцитов   и   молок   рыб   в   1869   г.   Фридрихом Мишером.   Ее   название   –   нуклеиновая   кислота   обусловлено   тем,   что   она   обладает кислотными свойствами и была обнаружена в клеточных ядрах (от латинского «nucleus» – ядро). ДНК содержится главным образом в составе хромосом клеточного ядра. Доказано, что   ДНК   содержится   также   и   в   составе   некоторых   самовоспроизводящихся   структур цитоплазмы – в митохондриях и хлоропластах. Это так называемая цитоплазматическая ДНК. Существующее ныне представление о структуре ДНК сложилось только в начале 1950­х  годов.   Дж.   Уотсон   и   Ф.   Крик     в   1953  году   предложили   модель   молекулярной структуры ДНК и механизм ее репликации. 4 Элементарные понятия о ДНК, генах и структуре хромосом, общебиологические законы наследственной изменчивости изучаются в курсе средней школы. Уроки биологии знакомят обучающихся с основными биохимическими закономерностями жизнедеятельности клеток, объясняют структуру и функции ДНК, причины мутаций – ошибок репликации.            На уроках органической химии в детали структуры ДНК разбираются с точки зрения теории строения органических веществ.       К сожалению, при изучении столь важного материала не хватает наглядности, причина тому – сложность изучаемого материала.  Научные методы, позволяющие выделять  ДНК, слишком трудны как в техническом, так и в теоретическом плане.  В условиях школьных лабораторий   невозможно   найти   нужное   оборудование   для   проведения   работы.   А   так хочется собственными глазами  увидеть ДНК!            Разработка   и использование доступного метода выделения ДНК позволит каждому ученику увидеть ее не в качестве абстрактных схем и моделей, а как материю. Используя предлагаемый нами метод, каждый   может увидеть ДНК. Самое сложное оборудование, которое   требуется   для   этого   –   школьный   микроскоп.   В   нашем   распоряжении   были: световой и электронные микроскопы из виртуальной лаборатории «Архимед»),    и ткань животного организма. За основу  взят метод, предложенный В. Артамоновой в  статье «Как увидеть ДНК» (Химия и жизнь, Школьный клуб, 2002, №2, стр. 48­49.) Цель:     разработка   простого   и   доступного   метода   выделения   ДНК   из   биологического материала в условиях школьной лаборатории. Задачи: 1. отработать метод выделения ДНК из клеток; 2.   показать,   что   выделение   ДНК   возможно   в   условиях   школьной   лаборатории   без использования дорогостоящих реактивов и оборудования. Объект исследования: эукариотическая клетка животного организма. Предмет исследования: ДНК эукариотической клетки. Методы   исследования: (эксперимент).  теоретический   (изучение   литературы),   практический             Нами   была   выдвинута   следующая  гипотеза:  если   мы   оптимально   подберем биологические объекты, лабораторное оборудование и реактивы, то сможем выделить ДНК из биологического материала в условиях школьной лаборатории. 5 Ход исследования:     выделение ДНК проводилось из клеток печени крупного рогатого скота, ткани которой не перегружены белками и липидами, содержат мало межклеточного вещества и легко распадаются на отдельные клетки. В качестве  вещества,   разрушающего липидные   мембраны   клеток   и   липидную   мембрану   клеточного   ядра,       использовалось жидкое моющее средство «Санокс». Оно содержит щавелевую кислоту, которая разрушает жиры и, как бы «вскрывает» клетки, освобождая их содержимое.  От белков, окружающих ДНК,   освобождались,   используя   ферменты   свежего   сока   ананаса,   которое   содержит вещество  бромела нии   (англ. bromelain) —  протеолитический  фермент,   имеющийся   у растений  семейства   бромелиевых,   в   частности  ананаса.     Молекулы   ДНК   из   водного раствора   выделяли     этиловом   спиртом.     Для   наблюдения   использовался   школьный микроскоп   ЛОМО   Р1У4.2   и   электронный   микроскоп  Intel  Play,   совместимый   с компьютером.   С   помощью   последнего   были   получены   электронные   микрофотографии ДНК,   которые   сравнили   с   литературными   данными,   приведенными   в   монографии   А. Ленинджера «Биохимия» (М, «Мир», 1978). 1.1. Обзор литературы по проблеме Глава 1. Теоретическая часть      Огромное разнообразие молекул ДНК достигается разными их размерами и различной последовательностью мономеров – нуклеотидов. ДНК – это молекула, состоящая из двух спирально закрученных полинуклеотидных цепей. Ширина спирали составляет около 2 нм, тогда как длина может достигать сотен тысяч нанометров.           Мономерами   ДНК   являются   дезоксирибонуклеотиды,   состоящие   из   азотистого основания, дезоксирибозы (пентозы) и остатка фосфорной кислоты. Азотистые основания подразделяются на две группы – пуриновые (аденин, гуанин) и пиримидиновые (тимин, цитозин).   Нуклеотиды   соединяются   в   цепь   за   счет   связи   между   остатком   фосфорной кислоты   одного   нуклеотида   и   дезоксирибозой   другого   путем   образования фосфодиэфирного мостика. Между нуклеотидами соседних цепей возникают водородные связи, соединяющие комплементарные азотистые основания: А=Т, Г=Ц. 6 Рис.2. Строение молекулы ДНК      Нуклеотиды ДНК, соединяясь друг с другом, способны образовывать особенно длинные цепи;   молекулы   дезоксирибонуклеиновой   кислоты   являются   самыми   крупными   из   всех известных сейчас молекул. Молекулярный вес ДНК в некоторых вирусах достигает 150 млн., масса грамм­молекулы такого вещества равнялась бы 150 тоннам!      Роль ДНК в клетке заключается в хранении, воспроизведении и передаче генетической информации. Благодаря матричному синтезу наследственная информация дочерних клеток точно   соответствует   материнской.   В   настоящее   время   известно   множество   фактов, свидетельствующих  о том, что ДНК определяет специфичность и химические  свойства генов – единиц наследственности. 1.2. Структура ДНК      В 1953 году Д. Уотсон и Ф.Крик предложили детальную трехмерную модель структуры ДНК.   Модель   Уотсона­Крика   не   только   объяснила   многие   физические   и   химические свойства   ДНК,   но   позволила   также   высказать   предположение   о   возможном   механизме точной репликации ДНК. Рис.3. Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик и их модель ДНК.             Потребовалась   большая   изобретательность,   остроумное   сочетание   специальных химических методов и рентгеноструктурного анализа с теоретическими исследованиями, 7 чтобы определить внутреннюю структуру молекулы ДНК. Ее установление справедливо относят к числу величайших достижений нашего времени. Согласно этой модели, молекула ДНК представляет собой не простую, а сдвоенную цепочку нуклеотидов.       Пространственное строение молекулы ДНК, состоящей из двух взаимно закрученных цепочек нуклеотидов, похоже на своеобразную винтовую лестницу.           На   первый   взгляд   картина   напоминает   веревочную   лестницу,   каждая   «ступень­ перекладина» которой образована двумя азотистыми основаниями, «веревками» же служат цепочки   из   чередующихся   атомных   групп:   фосфата   и   дезоксирибозы.   Фактически   обе цепочки прочно скреплены химическими связями, которые возникают между азотистыми основаниями.           Дальнейшие   исследования   показали,   что   «ступень­перекладина»   не   может   быть образована двумя азотистыми основаниями в любой комбинации. Чтобы «конструкция» молекулы была прочной, все «ступеньки» должны иметь одинаковую длину. Однако по своим размерам аденин и гуанин значительно крупнее тимина и цитозина. Расстояние же между   «веревками»   повсюду   одинаково.   Это   значит,   что   одно   из   оснований   любой «ступеньки» должно быть большим,  а другое – маленьким,  то есть, допустимы только комбинации: аденин – тимин;             гуанин – тимин; аденин – цитозин;         гуанин – цитозин.      Химическое строение азотистых оснований позволяет им соединяться друг с другом не в любых комбинациях, а именно: аденин не соединяется с цитозином, а гуанин – с тимином. Поэтому молекулярная «лестница» ДНК может иметь «ступеньки» лишь следующих видов: аденин – тимин и гуанин – цитозин        В таких именно комбинациях и встречаются азотистые основания в двухцепочечных молекулах ДНК. Если каким­либо способом удалить из молекулы ДНК одно из азотистых оснований, то его место сможет потом занять только такое же основание, никакое другое не   подойдет   либо   по   геометрическим   размерам,   либо   по   способности   к   образованию химических связей.       Из всех функций, выполняемых мононуклеотидами в клетках, наиболее важная состоит в том, что  они служат «строительными блоками», то есть предшественниками при синтезе нуклеиновых   кислот.   Мононуклеотиды   построены   из   трех   главных   компонентов:   1) азотистого основания; 2) сахара пентозы; 3) фосфорной кислоты. Два класса азотистых 8 оснований,   обнаруженных   в   нуклеотидах,   являются   производными   двух   ароматических гетероциклических соединений: пиримидина и пурина. 1.3. Методы выделения и секвенирования ДНК      Методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот принято называть   методами  секвенирования.   Теоретически   это   несложно,   поскольку   все аминокислоты,   встречающиеся   в   природных   белках,   имеют   разные   свойства.   Поэтому, когда   был   расшифрован   генетический   код,   появилась   возможность   восстанавливать нуклеотидную   последовательность   соответствующего белка. Все эти методы крайне сложны.   ДНК   по   аминокислотной   последовательности           В   Москве   при   Институте   Молекулярной   Биологии   им.   В.А.   Энгельгардта   РАН существует группа секвенирования и картирования генома   человека, которой руководит ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук Захарьев В. М.  За прошедшие 10 лет группой получено более 20 грантов по программам, финансируемым такими фондами, как:   ГНТП   «Геном   человека»,   РФФИ,  INSERM,  INTAS.     Они   предложили   методику выделения ДНК из лейкоцитов крови. Эти   методики   очень   сложны   и   требуют   дорогостоящего   оборудования,   реактивов, определенных условий для проведения опытов. Они никак не могут быть воспроизведены в условиях школьной лаборатории и выполнены самими учащимися. Результаты знакомства с литературой по проблеме не решили поставленной задачи,  и мы продолжили поиски. В журнале «Химия и жизнь» нам попалась  статья В. Артамоновой «Как увидеть ДНК», где в простой и доступной форме изложен алгоритм выделения ДНК из растительных и животных клеток. В ходе работы нам приходилось корректировать и уточнять   метод,   предложенный   Артамоновой:   подбирать   количества   используемых веществ,  время обработки материала. Биологический материал: Глава 2. Практическая часть          Наиболее удачный вариант ткани для выделения ДНК –   печень млекопитающего животного.   Ее ткани не перегружены белками и липидами, содержат много клеток, мало межклеточного вещества и легко распадаются на составляющие. Реактивы и оборудование: 9  Сок ананаса свежевыжатый  55 – 100 мл. Освобождает ДНК от гистоновых белков, покрывающих ее своеобразной «шубой».  Детергент   (жидкое   моющее   средство   «Санокс»)   2   столовые   ложки.   Разрушает липидные мембраны клеток и ядерную мембрану, высвобождая ДНК.  Этанол  95%  15 – 30 мл. Экстрагирует молекулы ДНК из водного раствора.  Поваренная   соль   (NaCl)     0,9   г.   Создает   физиологическую   среду,   препятствуя разрушению молекул ДНК.  Пробирки, химические стаканы.  Пипетки.  Водяная баня.  Электронные весы.  Для   наблюдения   использовался   школьный   микроскоп   ЛОМО   Р1У4.2     и электронный микроскоп  Intel Play, совместимый с компьютером. Методика и этапы работы: 1. Поместили в миксер 100 г свежей говяжьей печени. 2. Добавили 0,9 г поваренной соли, растворенной в 100 мл холодной кипяченой воды. Соль необходима для того, чтобы клетки не полопались раньше времени. Присутствие соляного   раствора   снаружи   клетки   уравновешивает   давление   внутреннего содержимого на клеточную мембрану изнутри. 3. Ткань измельчали в миксере в течение 15 – 20 секунд. 4. Затем   процедили   через   сито,   покрытое   двойным   слоем   марли,   удалили   крупные фрагменты ткани. 5. В процеженную массу добавили 17 – 20 мл детергента, хорошо размешали и оставили на 10 минут.       Детергент разрушает липидную мембрану самой клетки и ее ядра. В результате такой обработки все клеточное содержимое выльется наружу и останется в растворе. Раствор становится   очень   вязким   и   более   светлым,   чем   была   клеточная   суспензия.   Изменение консистенции раствора является признаком того, что лизис прошел успешно. 6. Полученную смесь разлили в 3 пробирки по 5, 2 и 1 мл. 7. В 1­ю пробирку добавили 10 мл сока ананаса; во 2­ю пробирку – 2 мл сока ананаса; в 3­ ю пробирку 1 мл сока. 10 Пробирки   осторожно встряхивали, наклоняя. Если трясти слишком активно, можно «разрушить»  ДНК и ничего не увидеть. Вследствие этого, мы выявили оптимальное  соотношение количества клеток ткани и ферментов, необходимое для освобождения молекул ДНК от связанных с ней белков. Это соотношение: 2 мл суспензии клеток +  2 мл сока ананаса. О том, что белки разрушены,  можно судить по уменьшению вязкости раствора. 8.   После оседания суспензии клеток, в каждую пробирку осторожно пипеткой прилили              по 1 мл этанола. Через 5 минут этанол собрали  пипеткой  и перенесли в           чистую сухую пробирку.        Для ускорения ферментативных процессов пробирки  помещали в водяную баню при           37 С на 5 – 10 минут. Особенности  и алгоритм проведения работы:       При проведении практической части работы необходимо учитывать следующее: 1.  Для опыта берется охлажденная, но не замороженная говяжья печень. Ткань печени освобождается от пленки соединительной ткани – капсулы, режется на кусочки и измельчается в миксере. Здесь ткань распадается на клетки.             Ее помещают в стакан миксера и приливают 100 мл  холодной кипяченой воды,    растворив предварительно в воде 0,9 г  хлорида натрия.  Для выделения ДНК требуются целые, неповрежденные клетки, поэтому мороженные или консервированные продукты не годятся. 2. Взбивать   ткань   в   миксере   достаточно   несколько   минут.   Затем   тканевую   массу необходимо процедить через двойной слой марли, чтобы освободиться от крупных фрагментов ткани и получить для работы однородную клеточную суспензию. 3. Теперь   следует   обработать   полученные   клетки     детергентом.   Для   этой   цели подходит жидкое моющее средство для посуды. 4.   К   100   г   суспензии   клеток   мы   добавляем     «Санокс»   в   объеме   10   мл,   хорошо размешиваем и подготовительный этап работы закончен, он занимает не более 10 минут. 5. Затем режется на ломтики ананас. Сок ананаса, вытекающий при этом, потребуется на следующем этапе работы.            Нам необходимо освободиться от белков, которые образуют прочные комплексы с ДНК. От них мы избавимся с помощью ферментов, способных разрушать эти молекулы. 11 Именно такие вещества содержит сок ананаса. Сами эти ферменты – тоже белки, поэтому ананас должен быть свежим плодом, а не соком в упаковке. 6. Выделение ДНК         В каждую пробирку, к 2 мл суспензии клеток прибавляем 2 мл ананасового сока и помещаем пробирку в водяную баню (стакан с теплой водой, не выше 36 С).   Клеточная масса сжимается и опускается на дно пробирки. По времени процесс идет 10­15 минут. 7. Третий   этап   работы   –   выделение   ДНК   из   раствора,   находящегося   над   массой клеток.   Этот этап – самый ответственный.   Приливать спирт в пробирку с ДНК­ содержащей смесью следует осторожно пипеткой по стенкам пробирки, наслаивая его   сверху.   Когда   нижние   слои   спирта   смешаются   с   раствором   ДНК,   начнется процесс   кристаллизации   нуклеиновых   кислот,     и   они   всплывут   в   виде   белого облачка. 8. Осторожно,   пипеткой   следует   взять   каплю   этого   облачка   и   поместить   на предметное   стекло.   Покровным   стеклом   пользоваться   не   надо,   так   как концентрация   ДНК   в   растворе   невелика,     в   тонком   слое   жидкости   увидеть   ее сложнее.   Спирт   испаряется   быстро,   и   фрагменты   ДНК   быстро   разрушаются, поэтому каплю следует сразу поместить под микроскоп.             Конечно,   увеличение   школьного   микроскопа   не   позволит   достоверно   установить структуру   молекулы.   Но   молекулы     ДНК     в   виде   клубков,   нитей,     «червячков»     и «запятых» видно при увеличении  школьного микроскопа совершенно отчетливо. Особенно хорошо видны крупные молекулы ДНК под микроскопом, соединенным с компьютером, в этом случае их можно сфотографировать.        Примечание: если сравнить фотографию ДНК, полученной в результате нашего опыта, с   фотографиями,   представленными   серьезными   научно­исследовательскими лабораториями, то очевидно – они очень похожи. Сравнительный анализ фото позволяет нам предполагать, что выделенный нами материал является  фрагментом хромосомы.(см. приложение 1.) Выводы и заключение        В результате проделанной работы доказана возможность выделения ДНК в условиях школьной лаборатории по следующим причинам:  Простота манипуляций, доступна школьникам.  Минимальное затраченное время на проведение эксперимента. 12  Доступность цен используемых материалов и реактивов.                Данный опыт можно рекомендовать к проведению на уроке биологии по теме: «Клетка», а также на уроке органической химии при изучении структуры нуклеиновых кислот. Эта работа может быть проведена на занятиях школьных кружков по химии или биологии, при проведении факультативов или элективных курсов. Перспективы дальнейшей работы      Перспективы дальнейшей работы мы видим в следующем: 1. Поиск  и практической использование  доступных в школьных условиях методик  выделения и изучения ДНК различных эукариотических клеток; 2. Изучение влияния различных  неорганических и органических соединений на разрушение молекул ДНК. Список  литературы 1. F. Sanger, Coulson A. R. /A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase./ J. Mol. Biol.,1975, v. 94, p.444­448. F. Sanger, S. Niclein, Coulson A. R./ DNA secuencing with chain­  terminating inhibitors./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, p.5463­5467. 2. A. M. Maxam, Gilbert W./ A new method of sequencing DNA./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p.560­564. 3. Группа секвенирования и картирования генома человека. 119991, г. Москва, В­334, ул. Вавилова 32, тел. (095) 135­97­70. 5.  Артамонова В./ Как увидеть ДНК. (Школьный клуб) / Химия и жизнь, 2002, №2, стр.48­49. 6.  К. Вилли/ Биология, Изд­во «Мир», Москва, 1968. 7.  Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор / Биология, т.1,3, Изд­во «Мир», Москва, 1990. 13 8. А. А. Каменский, А. И. Ким и др. / Справочник студента: Биология, Изд­во «АСТ», Москва, 2001. 9. Общая   биология,   под   ред.   академика   Д.К.   Беляева,   Москва,   Просвещение,   1979. Пособие для учителей. 10.А. Ленинджер. Биохимия, перевод с английского под ред. доктора химических наук Я. М. Варшавского, Москва, Мир, 1978. 14