Методы выделения и изучения веществ живой природы.

Методы выделения и изучения веществ живой природы. 1. Методы выделения и изучения белков.  2. Методы выделения и изучения ферментов. 3. Методы выделения и изучения полисахардов. 4. Методы выделения и изучения нуклеиновых кислот. Методы выделения и изучения  белков. Получение белков путем вьделения их из природных источников  является наиболее реальным методом. Осуществлены синтезы многих белков (инсулин, рибонуклеаза, лизоцим, цитохром  с,  соматотропный гормон, ацилпереносящий белок, кардиотоксин, ингибитор гастрина, ингибитор трипсина, аполипопротеин, ферредоксин и  др.)  Процесс синтеза белка очень сложен, трудоемок, требует значительной затраты времени и материальных затрат.  При выделении белков из природных материалов имеются определенные трудности ­ белки обладают особой чувствительностью к действию большинства химических реагентов (кислот, щелочей, органических растворителей и др.) и разрушаются при нагревании, перегонке, возгонке, экстракции. Белок при этом очень  легко теряет свои природные  нативные свойства (растворимость, биологическую активность и т. п.), и переходит в  денатурированное состояние.  Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделения, все операции проводят в мягких условиях: при низкой (не выше + 5° С) температуре, избегая действия резких химических реагентов. Впервые белок (клейковина) был выделен Я. Беккари из пшеничной муки в 1728 г. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка. В 1762 г. началась работа по изучению белка молока—казеина  (А. Халлер), затем  с 1789 г.—белков крови (А. Фуркруа). За два с половиной столетия из природных источников получены сотни различных белков и изучены их свойства. Измельчение. Для выделения белка из биологического объекта необходимо измельчение тканей   до   разрушения   клеточных   стенок.   Для  этого   используют   валковые   или   шаровые мельницы, гомогенизаторы.  Для   разрушения   клеточных   стенок   эффективно   используется   метод   попеременного замораживания и оттаивания биологического материала.  Кристаллики льда разрывают стенки клеток и клеточное содержимое освобождается.  Для разрушения клеточных стенок также используется метод «азотной бомбы», который заключается   в   том,   что   суспензия   клеток   насыщается   газообразным   азотом  под   высоким давлением, давление сбрасывают, азот, проникший  внутрь клеток, выделяется в виде газа и «взрывает» их. 1 А—валковая   мельница,    В—ручной   гомогенизатор,   механический гомогенизаторД—рабочая камера прибора для измельчения пресс­методом   Б—шаровая  мельница,    Г— Методы разрушения (дезинтеграции) биологического материала (по Б. А. Фихте и Г. А. Гуревичу, 1988) Физические.  Баллистические;   экструзионные;  ультразвуковые;   газодекомпрес­ сорные; гидроударные; электрогидроударные; комбинированные. Осмотический,  тепловой   или   холодовый   шок;   замораживание   —  оттаивание;   дегидратация—регидратация;   медленная   газовая замораживание   —высушивание;   декомпрессия; фазовые переходы  при высоких давлениях. Химические. Действие щелочей, кислот, солей, детергентов, антибиотиков, хелатных агентов, органических растворителей. Энзиматические.  Действие   бактериологических,  дрожжелитических,   миколитичес­ ких ферментов и иммобилизованных  литических ферментов. Биологические.  Действие   фагов,   бактерио   факторов.   Ингибирование     синтеза клеточной оболочки. Автолиз. После измельчения, из материала извлекают белки. Для извлечения белков наиболее часто используют солевые растворы. Большая часть белков хорошо растворима в солевых растворах  с  концентрацией 8— 10%. Различные соли обладают разным растворяющим действием по отношению к белку. Ряд катионов и анионов, расположенных в порядке убывания их растворяющего действия: Li+>К+>Nа+            Р2О7 4­>В407 Максимальным   растворяющим   действием   должен   обладать   пирофосфат   лития, 3­ >СNS ­>НСОз­ >I>Сl­ 2­ >РО4 минимальным—хлорид натрия. На растворение белков сильное влияние оказывает рН среды, поэтому большинство солей применяют в виде буферных смесей (фосфатных, ацетатных, боратных, нитратных и т. п.). Наиболее   широко   используют   буферные   смеси,   составленные   с   применением органических соединений—трис­(оксиметил)­аминометана (НОСН2)зСNН2  и его соли с НС1 (трис­буфер); диэтилбарбитуровой кислоты и ее натриевой соли (веронал­мединаловый буфер); NN­бис­(2­оксиэтил)­глицина   (НОСН2СН2)NСН2СООН   (бициновый  буфер);   К­[трис­ (оксиметил)­метил]­глицина (НОСН2)3СNНСН2СООН (трициновый буфер) и т. п. Для извлечения белков используют спирто­солевые смеси. Металлопротеины, которые при этом образуются   обладают разной растворимостью в спирте, что позволяет извлекать индивидуальные   белки   при   различной  концентрации   спирта.   Широко   применяют   для экстракции белков  глицерин, предохраняющий их от денатурации.Извлечению  белков из биологического материала способствует его  обработка детергентами: додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия и др  Детергенты   ослабляют   гидрофобные   белково­липидные  и   белок­белковые взаимодействия,   результатом   чего   являются   деструкция  биологических   мембран   и высвобождение из них структурных и функциональных белковых компонентов. Выделение   белков   из   растительного   материала   связано   с   трудностями   разрушения клеточной стенки растительной клетки.  При выделении белков из вегетативных органов растений используют: обработку тканей водно­эфирной смесью,  повышающей проницаемость   оболочки   растительной   клетки   (метод Чибнелла), экстракцию белков смесью фенола, уксусной кислоты и воды (метод Синджа) и др. После   получения   смеси   белков   из   биологического   материала   проводят  разделение полученной смеси на индивидуальные белки. Полученная смесь содержит брльшое количество различных белков.  2 Фракционирование  белков   ведут   разными   способами:   солями,   органическими растворителями,   с   использованием   электрофореза,   хроматографических   методов,   методом молекулярных сит и др. Метод фракционирования белков солевыми растворами  основан на том, что  каждый индивидуальный белок из смеси осаждается при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения  белка   из   раствора   под   действием   соли   называется  высаливанием. Последовательно увеличивая содержание соли в реакционной среде, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки.  Осаждение этиловым спиртом.  Процесс   ведут   при  температуре   около  5°  С,  чтобы предотвратить   денатурацию   белка.   Используя   различные   концентрации   спирта   удается выделить различные фракции белков.  Этот метод нашел широкое применение при выработке заменителей крови, так как позволяет   извлекать   из   нее   необходимые   ингредиенты  и   длительно   сохранять   их.   При фракционировании белков иногда сочетают высаливание и осаждение спиртом.  Метод осаждения ионами тяжелых металлов. Метод используется в сочетании с другими методами фракционирования (высаливание, осаждение  органическими растворителями). Метод основан   на   взаимодействии   ионов   Нg,  Zn,   Са,   Ва,   РЬ,  Fе,   Си  реакционноспособными аминокислотными радикалами белковой молекулы (Нg2 +—с сульфгидрильными группами, Zn2+ —с имидазольными, Са2+ и Ва2+—с радикалами фосфосерина и т. п.) Метод электрофореза  основан на способности различных белков перемещаться под lействием   электрического   поля   с   неодинаковой   скоростью  в   растворе,   на   влажной фильтровальной  бумаге   или   в   другой   твердой   опорной   среде.   Напряжение   при   этом устанавливают   от   нескольких   сотен   до   нескольких   тысяч   вольт,   силу   тока—в   несколько десятков миллиампер. Скорость передвижения белковых молекул определенного вида к аноду или катоду является функцией электрического заряда, молекулярной массы и формы молекул, ионной силы, рН и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Сочетание перечисленных факторов всегда специфично для каждого индивидуального белка, и естественно, что разные белки обладают различной электрофоретической подвижностью. Наибольшее   распространение   получил   электрофорез   в   твердых  средах:   целлюлозе, ацетилцеллюлозе,   На электрофореграммах   белки   выявляют  с   помощью   красителей:   амидового   черного (амидошварц 10В), бромфенолового синего, кумасси бриллиантового голубого.   крахмальном   и   полиакриламидном   гелях.   агар­агарt, Хроматографический метод разделения белков.  Метод заключается в пропускании смеси белков  через колонку, заполненную адсорбентом. В качестве  адсорбента  применяют производные  целлюлозы и  сефадекса,  несущие  ионообменные  группировки  (аминоэтильные, сульфоэтильные,   карбоксиметильные   и   др.),   гель   фосфата  кальция,   силикагель   и   другие носители.  Фракционирование   белковых   смесей   идет   очень   эффективно,   если   носители избирательно   связывают   строго   определенные   белки.   Такой   вид   хроматографии   называют хроматографией сродства или аффинной хроматографией.  Одной   из   ее   модификаций   является   хроматография,   основанная   на   гидрофобном взаимодействии   носителя   (фенил­   или   октилсефароза)   с   соответствующими   неполярными аминокислотными   радикалами   белковых   молекул.  Применение   эффективных   сорбентов (различные производные силикагеля)  и высокого давления при элюировании с них белков привело к возникновению ряда вариантов жидкостной хроматографии высокого разрешения. Механизм ионообменной хроматографии белков.  Для элюции адсорбированных белков с колонки используют солевые растворы, имеющие различные концентрации и значения рН. Элюат собирают небольшими порциями (по несколько миллилитров)   в   отдельные  пробирки   при   помощи   специальной   установки—коллектора 3 (сборщика)   фракций.   Количество   проб   в   процессе   фракционирования   белков   на   колонке хроматографическим методом ­ несколько сотен. В результате проведения цветной реакции на белок   или   путем   измерения   поглощения   каждого  раствора   в   ультрафиолетовой   области спектра устанавливают содержание  белка в каждой пробе. По данным строят кривую, и определяют  сколько   фракций   белка   содержится   в   элюате  и   в   какой   серии   пробирок находится   каждая   фракция.   Одноименные   пробы  объединяют   и   из   полученного   раствора выделяют чистый белок. Фракционирование   белков   методом   молекулярных   сит  основано   на   различной скорости   перемещения   белковых   молекул   (в   зависимости   от   молекулярной   массы)   через колонку,   заполненную   специальным   материалом—сефадексом.   Сефадекс   получают   путем обработки эпихлоргидрином полисахарида ­  декстрана, в результате чего между молекулами последнего возникает то или иное число поперечных связей: Получение сетчатого полимера сефарозы  обработкой полисахарида—агарозы 2,3­ди­ бром­пропанолом в резко щелочных условиях приводит к возникновению позволяет получить гели, пригодные для фракционирования  белков   с  молекулярными   массами  в  сотни  тысяч дальтон. В зависимости от числа поперечных связей в сефадексе и размера белковых молекул белковые молекулы по разному проникают внутрь  гранул сефадекса, заполняющих колонку. Большие белковые  молекулы,  не  способные пройти через сито из ячеек в гранулу, быстро выносятся   из   колонки   с   током   элюента;   мелкие   молекулы   белка,   проникшие   внутрь   зерна сефадекса, удерживаются некоторое время и выходят из колонки с последующими порциями элюата. Колонка с сефадексом как бы просеивает через себя молекулы белка по их размерам, первыми выходят самые крупные молекулы. Так как гранулы  сефадекса сильно разбухают в растворителе и образуют гель, этот метод называют также методом гельфильтрации. Метод   гельфильтрации   с   использованием   различных   материалов   нашел   широкое применение для разделения нуклеиновых кислот, высших углеводов и других биополимеров. ОЧИСТКА   БЕЛКОВ.  Для   освобождения   выделенных   фракций   белков,   белки подвергают   дальнейшей   очистке   путем  диализа,   электродиализа,   ультрафильтрации   и перекристаллизации, гельфильтрации и другими способами. Очистка белков методом  диализа  состоит в длительном, в течение нескольких суток, пропускании воды через сосуд, в который погружен диализационный мешочек. Диализационный мешочек готовят из материалов, хорошо проницаемых для низкомолекулярных соединений и ионов,   но   не   пропускающих   крупных   молекул  белка.   Материалом   для   полупроницаемых мембран   служит   целлофан,   размер  пор   которого   можно   изменять   в   широких   пределах обработкой раствором  ZnС12. Внутрь диализационного мешочка (камеры) помещают раствор белка. Камеру снабжают капиллярной трубкой. В нее устремляется часть белкового раствора в первые часы диализа и объем возрастает вследствие поступления воды внутрь камеры. 4 После длительной очистки белка путем диализа в нем остается некоторое количество ионов, сорбированных, белковыми частицами. Для полного удаления ионов используют метод электродиализа:  возле   полупроницаемых   мембран   диализационной   камеры   помещают электроды, на которые подают напряжение, в результате чего остатки ионов  поступают в омывающую мембраны воду и выносятся из аппарата. Ультрафильтрация.  Для   ультрафильтрации   используют   полупроницаемые мембраны высокой прочности из нецеллюлозных материалов с калиброванными порами, через   которые   проходят   низкомолекулярные   вещества,   но   не   проникают высокомолекулярные   белки.   Белковый   раствор   продавливают   через   такую   мембрану сжатым газом или центробежной силой. Белок, остающийся в процессе ультрафильтрации на мембране очищается от низкомолекулярных соединений и ионов и концентрируется. Ультрафильтрация может использоваться и для фракционирования белков. В   настоящее   время   доказано,   что   любой   белок   может   существовать   в кристаллической   форме.   В   основе   различных   приемов  кристаллизации  белка   лежит принцип   очень   медленного   приближения   к   той   критической   точке,   в   которой   белок  из растворенного состояния переходит в осадок. В этом случае белковые молекулы  успевают закономерным путем объединиться в надмолекулярные агрегаты  и  дают  кристаллические структуры. Практически такое медленное осаждение белков достигается путем введения соли   через   полупроницаемую   мембрану   или   при   медленном   испарении   воды   из содержащего соль белкового раствора вплоть до  точки высаливания. В последнее время получила   распространение   кристаллизация  белков   с   использованием   органических соединений: 2­метил­2,4­пентадиола и полиэтилен­гликоля.  5 Виды   белковых   кристаллов.   Кристаллические   белки   особенно   полученные   в результате перекристаллизации, отличаются высокой степенью чистоты.  МОЛЕКУЛЯРНАЯ   МАССА   БЕЛКОВ.   Молекулярную   массу   белка   измеряют различными физическими методами: гравиметрическим, вискозометрическим, осмометрическим, ультрафильтрационным, гельфильтрационным, электрофоретическим, оптическим. Полученную величину принято называть физическим значением молекулярной массы белка; она определяется с точностью в несколько сотен и тысяч дальтон.  У   многих   белков   в   настоящее   время   выяснена   первичная   структура,   что   дает возможность рассчитать молекулярную массу с точностью до сотых долей дальтона, т. е. получить химическое значение молекулярной массы белка.  Определение   молекулярной   массы   белка   гравиметрическим   методом   ведут   в аналитических ультрацентрифугах. Принцип количественного изучения размеров взвешенных частиц в центробежном поле А. В. Думанский выдвинул еще в 1913 г., и он же пытался определить размеры частиц по скорости оседания в обычных лабораторных центрифугах.  Первая   ультрацентрифуга   с   оптической   приставкой,   позволяющей   наблюдать   и фотографировать   процесс   седиментации   (оседания)   частиц,   была   построена   шведским физико­химиком   Т.   Сведбергом.   При   вращении   ее   ротора   развивалось   центробежное ускорение, превышающее ускорение силы тяжести всего в 150 раз. В   современных   типовых  ультрацентрифугах   превышение   достигает     300000,  а   в специализированных—900000—1200000.  Эту   величину   называют  относительным   центробежным   ускорением  или  фактором разделения:  Фр= ω2/ r  g  ,   где  = ω   ­ угловая скорость ротора, рад/с;  r­—расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см; g —ускорение силы тяжести, см/с2.  Например, запись 100000g означает, что центробежное ускорение в месте расположения ячейки в роторе ультрацентрифуги превышает ускорение силы тяжести в 100000 раз. Величина достигаемого в ультрацентрифуге фактора разделения—одна из важнейших ее характеристик. Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для  световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием   центробежной   силы  постепенно   оседают   на   дно.   Фотоприставка  к ультрацентрифуге   позволяет   делать   снимки   содержимого   ячейки   через   определенные промежутки времени и определять таким образом скорость оседания белковых частиц.  Для   определения   молекулярной   массы   белков   также   широко   применяют: гельфильтрационный и электрофоретический методы. Первый состоит либо в определении объема элюента, необходимого для выноса белка из колонки   с   гелем   сефадекса   и   соотнесении   его   со   свободным   объемом   колонки,  либо   в установлении длины пробега белка в тонком слое сефадекса на пластинке. Оба показателя связаны зависимостью со значением молекулярной массы белка. Пользуясь калибровочными графиками, построенными по по длине пробега маркерных (т. е.  с известной молекулярной массой) белков, находят молекулярную массу исследуемого белка. Методы   выделения   и   изучения   ферментов.  Долгое   время   считали,   что   все 6 ферменты—тела   белковой   природы.   В   начале   80­х   годов   была   открыта   каталитическая активность   у  низкомолекулярных   рибонуклеиновых   кислот,  т.   е.  возникло   представление   о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами. Выделяют   ферменты   так   же,   как   и   другие   белки,   но   есть   приемы,  применяемые преимущественно для ферментов. 17 Экстракция   глицерином.   Из   тканей   или   вытяжек   ферменты   экстрагируются глицерином, при этом сохраняются нативные свойства ферментов.  Метод ацетоновых порошков, который состоит в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты.  Адсорбционный   метод   выделения   и   очистки  ферментов.  Этот   метод   с использованием различных адсорбентов был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал   мощный   толчок  развитию   ферментологии.  Наряду   с   ним   широко   применяют   метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез.  Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала ­ лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты.   Для защиты от денатурации ферментов, выделение ферментов проводят в присутствии защитных добавок ­ НS­содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.): НS—СН2—СН2—NН2     НS—СН2—СH(ОН)—СН(ОН)—СН2—SН Цистеамин На всех этапах выделения ферментов поддерживается низкая  температура, так как некоторые   из   ферментов   при   —80°   С   теряют   активность.   Для   оценки   гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. Получены препараты высокой чистоты в кристаллическом состоянии.  Дитиотреитол Методы   выделения   и   изучения   полисахардов.  Биологические   материалы содержат   различное   количество   полисахаридов..   особенностью   которых   является   их плохая растворимость в воде – крахмал, гликоген, целлюлоза, хитин . лигнин, пектиновые вещества   и   другие   олигосахара.   Для   выделения   из   тканей,   клеток   полисахаридов используют физические, химические и биологические методы. Биологические материалы измельчают.   Затем   при   охлаждении   обрабатывают   химическими   агентами   например: трихлоруксусной   кислотой,   этанолом   и   др.   Для   определения   химического   состава полисахаридов использую кислотный, щелочной гидролиз, который проводят в жестких условиях (высокая температура, давление) Метод   определение   клетчатки   (по   А.   И.   Ермаковой).   основан   на  окислении   и растворении   различных   веществ,   сопутствующих   клетчатке,   при   обработке   ее   НNО3  в этиловом спирте и водном растворе щелочи.  В   настоящее   время  разработаны   методы   определения   количества   крахмала.   Их можно" разделить на пять групп:  методы, основанные на прямом определении крахмала или на определении веществ, сопутствующих ему;  химические методы, основанные на гидролизе кислотами или ферментами, а также на комбинированном  гидролизе этими реагентами, с определением крахмала в виде глюкозы или мальтозы редукционными методами;  поляриметрические и рефрактометрические методы;  методы определения количества крахмала по относительной плотности растворов;  биологические методы.  Выбор  того   или   иного   метода   зависит   от   характера   исследуемого   растительного продукта. 7 Например:   определение   количества   крахмала   (по   Н.   И.   Проскурякову   и  А.   Н. Кожевниковой).   Этот   метод   используется     при   исследования   зерна,  муки   и   других растительных продуктов, богатых крахмалом, но содержащих мало гемицеллюлоз. В основе этого   метода   лежит   растворение   крахмала   щелочью,   осаждение   его   иодом   и   спиртом, кислотный гидролиз крахмала и определение глюкозы по одному из редукционных методов Для проведения более точных исследовний и получения крахмала в чистом виде был разработан   диастатический   (ферментативный)   метод   определения   крахмала.   Обработка навески растительного материала в определенных условиях диастазом позволяет отделить крахмал   от   других   углеводов.   Диастаз,   как   и   другие   ферменты,  обладает   строгой специфичностью   и   расщепляет   только   крахмал,   переводя   его   в   растворимое   состояние. Растворимые   продукты   ферментативного   расщепления   крахмала   отфильтровывают, отбирают определенное количество прозрачного фильтрата и проводят гидролиз НС1.  В гидролизате определяют глюкозу описанными методами. Весьма существенным недостатком ферментативного метода является длительность определения. Методы выделения и изучения нуклеиновых кислот. Химия нуклеиновых кислот в последнее время развивается быстрыми темпами, что связано важнейшей биологической ролью   этих   соединений   в   клетках   и   живых   организмах.   Нуклеиновым   кислотам принадлежит очень важная роль в обеспечении специфического синтеза биополимеров в организме  Нуклеиновые кислоты были впервые выделены Ф. Мишером в 1869 из ядер клеток гноя   в   виде   соединения   с   белком—   нуклеина   (от   лат.  пиcleus—ядро),   а   сам   термин предложен   А.  Косселем   в  1889  г.  К  концу  прошлого  века   нуклеиновые  кислоты  были получены из животных тканей и дрожжей Р. Альтманом (1899), из растительного материала — А. Н. Белозерским с сотр.. в 1936 г. Большая   часть   нуклеиновых   кислот   в   растительных,   животных   и   бактериальных клетках   находится   в   соединении   с   белками.  Поэтому,   кроме   разрушения   клеточных оболочек   путем   гомогенизации   биологического   материала,   для   выделения   нуклеиновых кислот   необходимо  разорвать   связь  между   нуклеиновой   кислотой   и   белком.  Это достигается обработкой материала крепким раствором соли, например 10%­ным раствором №С1.   Одновременно  осуществляется   извлечение   нуклеиновых   кислот.   После   удаления твердого   остатка  нуклеиновые   кислоты   осаждают   из   охлажденного   до   0°   С   раствора этанолом или раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием, тщательно промывают и высушивают. Фенольный метод  выделения нуклеиновых кислот, при помощи которого можно получать   их   нативные   препараты.   Для   этого   измельченную   в   гомогенизаторе   при охлаждении ткань заливают водонасыщенным раствором фенола, энергично встряхивают смесь в течение 1 ч и центрифугируют ее. При этом содержимое центрифужной пробирки разделяется на четыре четко отграниченных друг от друга разных по консистенции и цвету слоя.   В   верхнем,   водном,   слое   и  подстилающем   его   вязком   слое   белого   цвета сосредоточена основная масса нуклеиновых кислот. В третьем, желеобразном, прозрачном, желтоватом слое  находится фенол с растворенными  в нем белками.  Четвертый, самый нижний,   слой   коричневого   цвета   содержит   остатки   ткани,   денатурированные   белки   и ничтожную примесь нуклеиновых кислот. В процессе выделения нуклеиновых кислот происходит удаление белков поэтому этот называют фенольной депротеинизацией. Очистить нуклеиновые кислоты от белка можно также  путем  обработки  их солевого экстракта  двойным объемом хлороформа.  После тщательного перемешивания в течение  15 мин, получается стойкая эмульсия. Смесь центрифугируют и отделяют верхнюю водную фазу, 8 содержащую нуклеиновые кислоты (денатурированный белок остается на границе водного и хлороформного слоев); нуклеиновые  кислоты  из  водной фазы осаждают  двойным  объемом охлажденного этанола. Для   фракционирования   полученных   препаратов   нуклеиновых   кислот   используются методы: хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. В результате  получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот. В настоящее время нуклеиновые кислоты получают не только выделением из природных материалов, но химическим синтезом. Разработка химических и инженерных подходов позволила Созданы   автоматические   синтезаторы   нуклеиновых   кислот,   отличающиеся   высокой производительностью (160 звеньев за 10 мин) и надежностью.  Химический синтез нуклеиновых кислот имеет большое значение для получения  генов, их фрагментов,   регуляторных   участков   нуклеиновых   кислот  и   т.   п.   Первый   синтез   гена  аланиновой транспортной рибонуклеиновой кислоты был осуществлен в 1972 г.  Г. Корана. Сейчас число синтезированных генов достигло нескольких десятков. В СССР синтезированы ген человеческого интерферона (М. Н. Колосов и др., 1982), ген валиновой транспортной РНК (М. Н. Колосов и др., 1983), ген кальцитонина человека (А. А. Баев и др., 1985), ряд промоторов и др. Молекулярная масса, содержание и локализация в клетке ДНК и РНКМолекулярную массу ДНК определяют в гидродинамическим и электронно­микроскопическим методами, измерением светорассеяние растворов ДНК и др. В   основе  гидродинамического   метода  лежит   линейная   зависимость   константы седиментации   ДНК,   определяемой   при   ультрацентрифугировании   растворов  ДНК,   от   ее молекулярной массы, которую можно установить по калибровочной  кривой или рассчитать по формуле: 0,4451gМ = 1,819+lg(  s°20,ω—2,7), где  s°20,ω—  константа седиментации, приведенная путем экстраполирования к бесконечному разведению (s°), стандартной температуре (20° С) и вязкости воды ( ).ω Электронно­микроскопический метод определения молекулярной массы ДНК основан на измерении длины вытянутых молекул ДНК. Известно, что на  0,1 нм протяженности ее молекулы  приходится масса, равная 197 Да. Умножая эту величину на экспериментально найденную длину молекулы ДНК, получают значение ее молекулярной массы. Выделить нативную ДНК из клеток эукариот достаточно трудно, так как еще не создано соответствующих   методов,   позволяющих   избежать   разрыва   выделяемых   молекул   ДНК. Определены молекулярные массы для ДНК вирусов и фагов; из них проще извлечь ДНК, сняв белковую оболочку. Молекулярные массы вирусных и фаговых ДНК измеряются десятками и сотнями миллионов дальтон. Следовательно, молекулярная масса ДНК эукариот значительно выше. Об этом свидетельсвует молекулярная масса ДНК, выделенной  из самой большой хромосомы плодовой мушки—дрозофилы. Вся ДНК хромосомы представлена одной молекулой с М=40 • 109. Молекулярные массы РНК определяют теми же методами, что и ДНК, но, кроме того, используют  электрофорез  в полиакриламидном геле, так как пробег РНК в геле обратно пропорционален их молекулярным массам.  9