Инструктивная карточка для проведения эксперимента "Определение аминокислот на коже"

Тема: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА КОЖЕ О п ы т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОАЗОТА (АМИНОКИСЛОТ) НА КОЖЕ К 1–2 мл водного смыва с кожи добавить 4–5 капель 0,5 %­ного водного раствора   нингидрина;   перемешать,   поставить   в   хорошо   кипящую   водяную баню   на   10–15   минут.   За   это   время   развивается   сине­фиолетовое окрашивание.  Параллельно выполнить  такую реакцию с водой (окраски не будет) и с раствором какой­нибудь аминокислоты, например, глицина (аминоуксусной кислоты). Реакция аминосоединений с нингидрином весьма чувствительна и широко применяется в биохимической практике. Она была предложена еще в 1910 году   немецким   химиком   Руэманном.   Поэтому   полученный   окрашенный продукт   с   длинным   названием   дикетогидриндилиден­дикетогидриндамин называется просто «пурпур Руэманна».  Широкое   распространение   получил   капельный   вариант   этой   реакции, который легко выполнить на уроке.  Итак,   на   полоску   фильтровальной   бумаги   нанести   каплю   смыва   или раствора   аминокислоты,  подсушить,  смочить   или   опрыскать  0,1–0,5 %­ным ацетоновым   или   спиртовым   раствором   нингидрина,   после   чего   хорошо прогреть   над   электроплиткой   или   в   сушильном   шкафу   до   появления фиолетового пятна. Можно даже написать раствором аминокислоты какую­ либо фигуру или слово и затем проявить его нингидрином.  При   попадании   раствора   нингидрина   на   кожу   через   некоторое   время появляются фиолетовые пятна, которые проходят через 2–3 дня. С помощью нингидриновой реакции можно проявить отпечатки пальцев на бумаге, дереве и т. п. Таким образом эту реакцию используют в криминалистике.  Откуда на коже аминокислоты? Во­первых, они образуются в результате апоптоза   клеток   эпидермиса   и   гидролиза   белков   кожи.   Во­вторых, аминокислоты   попадают   на   кожу,   так   сказать,   изнутри   в   результате потоотделения и неощутимой перспирации. С присутствием аминокислот на коже связана интересная история. В 60­е годы при изучении метеоритов ученые­аналитики обнаружили аминокислоты. Отсюда   был   сделан   однозначный   вывод   о   наличии   в   космосе   белкового вещества и каких­то форм белковой жизни. Позже, однако, выяснилось, что эти аминокислоты попали на метеоритные камни с рук исследователей. Эта «детективная»   история   изложена   в   статьях   известного   аналитика­ аминокислотника Пола Гамильтона.  Другая история сообщена в интересной книге Р. Райта «Наука о запахах». Оказалось, что смыв с кожи человека или шкуры животного вызывает тревогу у рыб. Это так называемый «фактор звериной шкуры». Методом исключения удалось   выяснить   природу   этого   фактора.   Оказалось,   что   это   вполне  ­ серин   конкретное   гидроксипропионовая   кислота).   что   среди   различных аминокислот, экскретируемых через кожу, доля серина составляет до 25 %. Наверное, поэтому в процессе эволюции серин и закрепился у рыб как сигнал опасности.     Любопытно, аминокислота соединение:   (­амино, Как химический реагент нингидрин широко применяется в современной аналитической биохимии и, следовательно, достаточно доступен и недорог, в порошке   в   темной   склянке   он   неограниченно   долго   сохраняется.   Также устойчивы   его   водные   и   спиртовые   растворы.   Думаю,   что   любой   учитель химии средней школы должен иметь в шкафу своего химического кабинета флакончик с бледно­желтым порошком нингидрина. В   свое   время   Гамильтон   обнаружил   в   смывах   с   большого   пальца практически   все   аминокислоты,   входящие   в   состав   белков.   Как   хорошо известно,   отличаются   друг   от   друга   белковые   аминокислоты   строением боковой группы (радикала). Например, серин и треонин имеют дополнительно гидроксильную   группу,   глутаминовая   и   аспарагиновая   кислоты   – карбоксильную   группу,   триптофан   и   гистидин   –   гетероциклы   и   т.   д. Воспользовавшись   этой   особенностью   аминокислот,   нетрудно   определить конкретную аминокислоту в сложной смеси разных аминокислот, например, в том же смыве с кожи.  О п ы т. ОБНАРУЖЕНИЕ  ГИСТИДИНА В СМЫВЕ Для опыта потребуются три реактива:  1)   1   %­ный   раствор   сульфаниловой   кислоты,   приготовленный   на   1 нормальном растворе соляной кислоты;  2) 0,5 %­ный раствор нитрита натрия;  3) 20 %­ный раствор карбоната натрия. К   1–2   мл   смыва   прибавить   последовательно   по   0,1   мл   вышеуказанных реактивов   и   наблюдать   появление   ярко­оранжевого   окрашивания. Желательно, чтобы реактивы были охлажденными (из холодильника).  Как   и   в   предыдущих   опытах,   для   сравнения   параллельно   поставить реакцию с водой и раствором гистидина или тирозина, если таковые имеются. Описанная реакция была предложена химиком Г. Паули в начале ХХ века, она основана на известном процессе диазотирования и азосочетания между сульфаниловой   кислотой   и   боковой   группой   гистидина   или   тирозина. Подобные   реакции   лежат   в   основе   получения   анилиновых   красителей   и описаны в любом учебнике по органической химии. В отношении кожных смывов требуется некоторое пояснение. Дело в том, что   в   поверхностном   слое   кожи   имеет   место   ферментативная   реакция внутримолекулярного дезаминирования гистидина (гистидазная реакция). В результате   этой   реакции   образуются   аммиак   и   урокановая (имидазолилакриловая) кислота. Последняя тоже дает реакцию Паули. Таким образом,   с   помощью   данной   цветной   реакции   мы   фактически   определяем одновременно гистидин, урокановую кислоту, тирозин и, возможно, гистамин. Однако   установлено,   что   два   последних   вещества   на   коже   содержатся   в настолько малых количествах, что практически не влияют на диазореакцию Паули.   Следовательно,   данной   реакцией   мы   открываем   в   кожном   смыве гистидин   и   урокановую   кислоту.   Последние   можно   разделить   с   помощью хроматографии   на   бумаге:   будучи   плохо   растворимой   в   водной   фазе, урокановая кислота при восходящей хроматографии высоко поднимается по полоске,   тогда   как   гистидин   практически   остается   на   старте  (см.  рис.  1). Обнаружить урокановую кислоту и гистидин можно, смочив хроматограмму свежеприготовленной   смесью  вышеуказанных   реактивов.  Сразу   появляются оранжевые   пятна,   соответствующие   гистидину   (на   старте)   и   урокановой кислоте (в верхней части хроматограммы). Разгонка хроматограммы занимает 20–25 минут. Можно использовать хорошую фильтровальную бумагу, лучше, конечно, специальную хроматографическую, но она в последние годы стала в России совершенно недоступной. Несколько   слов   о   биологической   роли   образующейся   в   эпидермисе урокановой кислоты. Имея в своей структуре  ­электронную сопряженную систему,   урокановая   кислота   улавливает   кванты   ультрафиолетового излучения солнечного света и тем самым предохраняет кожу от поражения солнечными лучами. В связи с этим приходит в голову идея использовать урокановую кислоту и, возможно, гистидин в составе солнцезащитных кремов и мазей. Диазорекция обладает высокой чувствительностью, образующееся цветное соединение   весьма   устойчиво.   Сохранность   растворов   реагентов   в холодильнике практически неограниченна. О п ы т. ОБНАРУЖЕНИЕ ТИРОЗИНА В СМЫВАХ С РУК Ароматическая   аминокислота   тирозин   выделяется   через   кожу   в   очень малых количествах, однако эту аминокислоту можно качественно обнаружить в кожных смывах, если последние немного сконцентрировать.  Итак, смываем тщательно все десять пальцев в 10 мл воды. Этот объем упариваем   в   фарфоровой   чашке   примерно   до   1   мл,   сливаем   в   пробирку, охлаждаем. Образец готов для анализа. Потребуются два реактива: 0,1 %­ный ацетоновый   раствор   1­нитрозо,2­нафтола   и   10   %­ный   раствор   азотной кислоты   (можно   воспользоваться   просто   концентрированной   азотной кислотой, добавляя ее в пробу в количестве всего 1–2 капель). К   1   мл   упаренного   смыва   добавить   0,1   мл   (2–3   капли)   раствора нитрозонафтола и 1 мл раствора азотной кислоты, перемешать и нагревать в кипящей   водяной   бане   до   появления   вишнево­красного   окрашивания. Естественно,   оно   появляется,   если   в   смыве   есть   тирозин.   Реакция   весьма чувствительна, но не очень специфична, например, фенол также дает такую цветную реакцию. Тирозин – это аминокислота, заслуживающая того, чтобы о ней поговорить. Прежде всего, это одна из первых аминокислот, открытых в белках. Еще в 1848 году ее выделил из молочного белка казеина молодой немецкий химик Бопп. Произошло это в лаборатории Юстуса Либиха, и именно Либих, по­ видимому, предложил название «тирозин». А то, что именно тирозин был так рано открыт, связано с тем, что эта аминокислота очень плохо растворима в воде (0,05 %) и легко выпадала в осадок. В организме животных и человека тирозин активно метаболизируется и является   предшественником   многих   биологически   важных   соединений.   В частности,   в   ткани   щитовидной   железы   из   тирозина   образуется   жизненно важный гормон тироксин, вернее, ряд гормонов – йодтиронины. Для этого синтеза   кроме   самого   тирозина   необходимы   еще   атомы   йода,   по   3–4   на каждую   молекулу   гормона.   Недостаточное   образование   тироксина   в щитовидной железе ведет к серьезным нарушениям функций организма. Если дефицит тироксина имеет место в детские годы, развивается существенное отставание в развитии, обозначаемое медиками как кретинизм. У взрослых это   приводит   к   микседеме   (слизистый   отек).   Тирозин   сам   ограниченно синтезируется в организме из другой аминокислоты фенилаланина. В ткани мозгового вещества надпочечников из тирозина образуются еще два   гормона:   норадреналин   и   адреналин.   Общая   схема   этого   синтеза представлена на рисунке.  При   отнятии   от   тирозина   карбоксильной   группы   (реакция декарбоксилирования)   образуется   местный   тканевой   гормон   тирамин.   Он обладает   разнообразным   биологическим   действием:   повышает   кровяное давление,   усиливает   пото­   и   слюноотделение,   расширяет   зрачки.   Однако образование тирамина более характерно для микроорганизмов, например, он накапливается в процессе созревания сыров. Наконец, в клетках кожи из тирозина синтезируются пигменты­меланины, придающие коже смуглый оттенок и защищающие кожу от солнечных лучей. У   людей   обнаружен   генетический   дефект   фермента   тирозиназы, проявляющийся в форме альбинизма. Таких людей называют альбиносами. У них   абсолютно   белые   волосы   и   кожа,   и   они   плохо   переносят   солнечное облучение (солнечные ожоги). Метаболически   тирозин   тесно   связан   с   другой   ароматической аминокислотой,   а   именно   с   фенилаланином.   Примерно   0,01   %   детей рождается   с   врожденным   молекулярным   дефектом,   у   них   отсутствует фермент, превращающий фенилаланин в тирозин. Естественно, что у такого ребенка в крови очень много фенилаланина и с мочой выделяется повышенное количество   фенилпировиноградной   кислоты.   Все   это   приводит   к   развитию слабоумия   (фенилпировиноградная   олигофрения)   и   ранней   смерти.   Если вовремя   выявить   это   заболевание,   оно   поддается   лечению   путем   резкого ограничения в пище фенилаланина. Можно сказать: подумаешь 0,01 %, редкое заболевание!   Однако   если   учесть,   что   на   Земле   более   6   млрд   жителей, оказывается, что носителей этого генетического дефекта не менее 600 000, то есть население большого города. Отметим, что нитрозонафтол используется в синтезе красителей, а также как   реактив,   обнаруживающий   соли   железа   (стойкое   темно­зеленое окрашивание). О п ы т. ОБНАРУЖЕНИЕ АМИНОКИСЛОТЫ АРГИНИНА В СМЫВАХ С КОЖИ Готовим достаточно концентрированный смыв. Десять фаланг пальцев рук отмываем в 2 мл воды. К 1 мл этого смыва добавляют последовательно два реактива:   0,1   –   0,2   мл   0,1   %­ного   спиртового   раствора   8­оксихинолина (оксина)   и   0,5   мл   раствора   гипохлорита   натрия.   Последний   готовим растворением   таблетки   «Жавел­солид»   в   200   мл   дистиллированной   воды. После добавления второго реагента в течение 1–2 минут развивается красно­ оранжевое   окрашивание   (цвет   мяса   семги),   что   указывает   на   присутствие аминокислоты аргинина. Только она из всех белковых аминокислот дает эту цветную реакцию. Неплохо поставить еще реакцию просто с водой (окраски нет) и с раствором аргинина, если таковой имеется. В этой пробе будет яркое красно­оранжевое   окрашивание.   Интенсивность   окраски   проб   постепенно снижается. Описанная здесь реакция известна с 1925 года, ее открыл японский ученый Сакагуши,   и   она   названа   его   именем.   Правда,   Сакагуши   вместо   оксина использовал  ­нафтол,   а   вместо   гипохлорита –   гипобромит.   Предлагаемая нами модификация по чувствительности не уступает оригинальной процедуре Сакагуши,   но   имеет   то   преимущество,   что   оксин   более   доступен   (его используют   как   дезинфицирующее   средство).   Кроме   того,   приготовление раствора гипобромита натрия связано с использованием дурно пахнущего и ядовитого   жидкого   брома.   Приготовление   гипохлорита   более   безопасно. Кстати,   вместо   таблеток   «Жавел­солид»   можно   использовать   бытовые отбеливающие   средства   «Белизна»,   «Тексанит»   или   даже   просто   хлорную известь. Естественно, что в этих случаях концентрацию второго реагента надо подобрать эмпирически, что совсем не трудно.  При   недоступности   аргинина   можно   предложить   для   цветной   реакции антибиотик   стрептомицин   (можно   просроченный).   Реакцию   дают   также бигуанидины, применяемые для лечения диабета. Реакция Сакагуши высокочувствительна, и хотя концентрация аргинина на коже в 100–300 раз ниже уровня таких аминокислот, как серин или аланин, его все­таки можно обнаружить. Можно предложить капельный вариант обнаружения аргинина: на кусочек фильтровальной   бумаги   нанести   каплю   смыва,   подсушить   и   смочить растворами оксина и затем гипохлорита. Появляется оранжевое пятно. Уместно сказать несколько слов об обнаруженной аминокислоте аргинине. Его структурная формула приводится ниже. Как видно из формулы, аргинин весьма   богат   азотом.   В   отличие   от   обычных   аминокислот   с   одной   только аминогруппой, в составе аргинина целых четыре атома азота. Можно сказать, что аргинин – это уникальный аккумулятор органического азота, и очевидно, что этой аминокислоты должно быть много в белках семян, икринок и другого зародышевого материала. Так оно и есть. Например, сальмин молок лосося почти на 80 % состоит из аргинина и лизина. Другая   особенность   аргинина   –   его   выраженный   основный   характер. Боковая   группа   аргинина,   содержащая   три   атома   азота   и   атом   углерода, называемая   гуанидином,   является   одним   из   самых   сильных   органических оснований.   Поэтому   растворы   аргинина   имеют   выраженную   щелочную реакцию. И соответственно белки с высоким содержанием этой аминокислоты – основные белки. NH2–C–NH–CH2–CH2–CH2–CH–COOH           ||                                             |          NH                                         NH2