Метаболизм белков.

Метаболизм белков. 1. 2. 3. БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ В ПРИРОДЕ. ПРОТЕОМИКА. СТРОЕНИЕ РИБОСОМ. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД Биосинтез белка в природе.  Проблема биосинтеза белка — одна из двух наиболее важных   и   острых   проблем   современного   естествознания:   если   в   неживой   природе принципиально   новые   пути  получения   энергии   будут  найдены   благодаря   успехам   физики элементарных частиц, то в живой природе решение кардинального вопроса управления самой жизнью может быть получено в результате познания химии и биологии белковых тел. Биосинтез белков в организме осуществляется весьма интенсивно. Средняя скорость сборки полипептидных цепей в клетках бактерий составляет 16­17 аминокислотных остатков в 1 с, дрожжей — 7­10, млекопитающих — 5­7. Время синтеза (в с) молекулы глобина  в ретикулоцитах кролика равно 20, овальбумина в яйцеводах курицы — 80; суммарных белков в печени крысы — 80. За 1 мин в ретикулоците кролика синтезируется 5∙104 молекул глобина, в   клетке   яйцеводов   курицы   —   6•105  молекул   овальбумина,   в   гигантской   клетке   заднего отдела   шелкоотделительной   железы   тутового   шелкопряда   —   38­1011  молекул   фиброина шелка. История   развития   представлений   о   механизме   биосинтеза   белков.  Первой   по времени   была  гипотеза   обращения   протеолиза.  В   1886   г.   А.Я.  Данилевский   наблюдал образование   белковоподобных   веществ   при   действии   ферментов   желудочного   сока   на концентрированный раствор пептонов, возникших в результате расщепления белка пепсином. Позже был расширен круг ферментов, способных к обращению протеолиза (трипсин, пепсин, папаин,   катепсины),   и   белков,   с   неполными   гидролизатами   которых   такое   обращение удавалось   осуществить   (альбумины,   глобулины,   фибрин,   казеин   и   др.).   Продукты, возникающие в результате обращения реакции гидролиза белков, назвали пластеинами. Определенный вклад в развитие современных представлений о механизме биосинтеза белков внесли исследования биосинтеза квазипептидных связей (т. е. не истинных пептидных связей, но близких к ним), осуществленные в 50­е годы в ряде лабораторий, в том числе у нас в   лаборатории   А.Е.   Браунштейна.   Эти   исследования   доказали   ферментативный   характер реакций их образования, необходимость энергообеспечения за счет окислительных процессов и, что самое важное, участие в биосинтезе квазипептидных связей АТФ. Существенными оказались результаты разработки  гипотезы  транспептидирования  в качестве   возможного   варианта   механизма   биосинтеза   пептидных   связей.   В   нашей   стране исследования в этом направлении интенсивно проводились в 50­е годы В.Н. Ореховичем с сотр.   При   изучении   реакций   транспептидирования   впервые   было   показано,   что   перенос аминоациальных   или   пептидильных   группировок   на   аминогруппу   аминокислот   может происходить не только с амидной или пептидной связи, но  и  со сложноэфирной связи. В дальнейшем   оказалось,   что   именно   этот   механизм   лежит  основе   реакции транспептидирования в рибосоме.  в Переломным   моментом   в   развитии   подходов   к   выяснению   механизма   биосинтеза белковых тел было установление сцепленности его с биосинтезом РНК (Ж. Браше, 1941; Т.  Оно   привело  к  созданию  матричной   схемы   биосинтеза  белков, Касперсон, являющейся фундаментом современных представлений.  1941). 1 Общая схема матричного биосинтеза  белковых тел Матричный   механизм   биосинтеза   полимеров,   обеспечивающий   безошибочное воспроизведение  их первичной структуры, представляет  одну из наиболее  специфических черт живого. Принципиальное значение в разработке вопроса о механизме биосинтеза белков имело выявление  локализации  его в  рибосомальном аппарате  клетки  и создание  бесклеточных систем, где единственной структурой, на которой протекал биосинтез белка, были рибосомы.  Наряду  с  матричным   механизмом   в   природе   существует  мультиэнзимный  путь биосинтеза белков и пептидов, где специфическое чередование аминокислот обеспечивается расположением каталитически активных белков в мультиэнзимном комплексе.  Исследования   по   выяснению   механизма   синтеза   белков   положили   начало   науки протеомики. Осуществление внеклеточного синтеза белка в биореакторах настоящее время позволяет получать белки самого различного состава. Биосинтез   белков   во   всех   структурных   элементах   клетки   (ядро,   митохондрии, хлоропласты, эндоплазматический ретикулум и др.) идет на рибосомах. Поэтому именно на пути исследования структуры и свойств рибосом, а также механизма их взаимодействия с исходными   для   биосинтеза   белков   соединениями   достигнуты   наиболее   впечатляющие результаты в выявлении закономерностей новообразования белковых тел. Строение   и   свойства   рибосом.  Рибосомы   —   мельчайшие   тельца рибонуклеопротеиновой природы. Они содержатся в основном в цитоплазме растительных, животных и бактериальных клеток в количестве нескольких десятков тысяч в каждой. Рибосомы   выделяют   путем   дифференциального   центрифугирования   клеточного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить   клеточное   содержимое   на   ряд   фракций.   Рибосомы   связаны   главным   образом   с мембранами эндоплазматической сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осаждаются вместе с обломками липопротеиновой мембраны — микросомами. Форма   и   структура   рибосом,   выделенных   из   разных   источников,   сходна,   но   по значению константы седиментации их делят на два класса: 70S и 80S. Первые найдены у всех 2 прокариот, а также содержатся  в ядрах, митохондриях и хлоропластах  эукариот; вторые локализованы в цитоплазме только эукариот. 70S   и   80S   рибосомы   стабильны   при   концентрации  Mg2+,   близкой   к   0,001   М.   При повышении   содержания  Mg2+  до   0,01   М   рибосомы   дают   димеры   или   слипаются   в   более крупные агрегаты, а при понижении до 0,0001 М диссоциируют на субчастицы: 70(80)S  = 30(40)S  +   50(60)S.   Этот   процесс   диссоциации—ассоциации   рибосом   и   их   субчастиц   — контролируется   также   полиаминами   и   изменением   концентрации   других   двухвалентных катионов. Рибосомы составлены из РНК и белка, варьирующих в зависимости от класса рибосом. Состав рибосом Класс рибосом Субчастицы рибосом РНК Число белков Молекулярные массы белков,  тыс. дальтон Соотношение РНК/белок, % 30S 16S 21 12— 65 37/63 70S 50S 23S 34 9— и 5S 31 4 36/6 80S 60S 28S, 5S H5.8S 41 10—54 40S 18S 31 10— 44 6 54/4 41/59 . Кроме белков и нуклеиновых кислот, в составе рибосом в ничтожных количествах обнаружены другие вещества: Mg2+ и Со2+, ди­ и полиамины, ряд других катионов (Fe3+, Zn2+, Al3+, Ba2+, Sr2+, Ni2+, Cr2+, NbU), а также латентная рибонуклеаза. Рибосомы в нативном состоянии, т. е. в живых клетках, сильно гидратированы: так, на 1 г сухого вещества рибосом из ретикулоцитов приходится 2,7 г гидратационной воды. Это свидетельствует об исключительно высокой «пористости» нативных рибосом. Белок и РНК в рибосомных частицах соединены очень непрочными связями: уже при инкубации с 0,5­1 М растворами солей при низкой температуре происходит отделение белка от нуклеиновой кислоты.  Связи   белков   с   нуклеиновыми   кислотами   в   рибосомах   оценивают   в   основном   как электростатические.  Высокое   содержание   в   суммарных   рибосомальных   белках   основных аминокислот (12% лизина, 11 % аргинина и 3% гистидина), заряженных положительно, и большое   число   межнуклеотидных   фосфатов   в   рибосомальных   РНК,   заряженных отрицательно,   обеспечивают   условия   для   возникновения   достаточного   количества   ионных связей между первыми и вторыми. В   течение   последнего   времени   достигнуты   большие   успехи   в   выяснении пространственного строения рибосом в целом и локализации в их субчастицах отдельных структурных элементов.  Сотрудники   Института   белка   в   Биологическом   центре   РАН   (г.   Пущино­на­Оке Московской   области)   —   здесь   под   руководством   акад.   А.   С.   Спирина   выполнили фундаментальные   исследования   по   изучению   рибосомального   аппарата   клетки. Принципиальное  значение для понимания того, как в рибосоме идет синтез белка, имеют данные   о   локализации   в   ней   центров,   где   осуществляются   важнейшие   этапы   биосинтеза полипептидной цепи:  связывание аминоацил­тРНК,  связывание   белковых   факторов,   необходимых   для   функционирования   рибосомы, считывание   информации   о   порядке   расположения   аминокислотных   остатков   в новообразуемом белке,  синтез пептидной связи,  удаление тРНК, высвобождающейся после образования пептидной связи,  3 перенос   пептидил­тРНК   из   аминоацильного   центра   в   пептидильный   центр   с одновременным продвижением мРНК на один триплет нуклеотидных остатков, гидролиз сложноэфирной связи между полипептидом и тРНК в момент завершения синтеза белка в рибосоме и др. Пространственная структура 30S ­субчастицы рибосомы кишечной палочки: Как перевести четырехбуквенный (по числу оснований, входящих в мРНК, т. е. А­ аденин, Г­гуанин, Ц­цитозин и У­урацил) код в двадцатибуквенный (по числу аминокислот, составляющих белковую молекулу)? Если   каждой   комбинации   нуклеотидов   в   мРНК   приписать   способность   кодировать положение одной аминокислоты в белке, то дуплетный код вряд ли возможен (число пар нуклеотидов менее числа постоянно встречающихся в белке аминокислот), квадруплетный нереален (число сочетаний слишком сильно превышает число аминокислот), в то время как триплетный   код   наиболее   удовлетворяет   численному   соотношению   возможных   кодонов   и белковых   аминокислот.   Указанные   расчеты   основаны   на   том,   что   при   соединении   4 нуклеотидов   попарно   можно   получить   16   комбинаций,   по   три—64,   по   четыре—256 комбинаций и т. д.:  Посредством   ряда   опытов   триплетная   природа   кода   белкового   синтеза   доказана экспериментально.   Сначала   был   установлен   качественный   состав   нуклеотидных   остатков, которые   входят   в   состав   одного   или   нескольких   кодонов,   обеспечивающих   вступление   в состав белка  той или иной аминокислоты.  Решающую роль здесь сыграло  наблюдение  М. Ниренберга (1961), который, используя в качестве мРНК полиуридиловую кислоту, впервые показал, что вступление в полипептидную цепь фенилаланина кодируется УУУ­триплетом. Полиуридиловая   кислота,   поли   (У),   вводилась   им   в   белок­синтезирующую   бесклеточную систему,   составленную   из   промытых   (лишенных   мРНК)   рибосом,   полного   набора   тРНК, аминоацил­тРНК­синтетаз и аминокислот (некоторые из последних мечены 14С или 15N), АТФ и генерирующих ее соединений (фосфоенолпируват, ацетилфосфат и подобные им вещества), ГТФ,  Mg2+  и Мп . В этой системе на поли (У) в качестве матрицы шел синтез пептидов, составленных только из остатков фенилаланина. Благодаря применению в этой же системе почти   полного   набора   синтетических   гомо­и   гетерополирибонуклеотидных   матриц, 4 полученных с помощью полинукле­отидфосфорилазы, в лаборатории С. Очоа в течение года была завершена работа по выявлению качественного состава кодонов для всех аминокислот. В результате уже к концу 1965 г. были получены полные данные о коде белкового синтеза в рибосомальном аппарате клетки.  Из 64 триплетов 61 кодирует последовательность вхождения аминокислот в полипептидную цепь в процессе ее биосинтеза в рибосоме. Три триплета (УАА, УАГ и УГА) не участвуют в кодировании. Однако и они играют важную роль в биосинтезе белка. Именно эти триплеты распознаются белковыми факторами терминации в тот   момент,   когда   они   окажутся   (по   мере   продвижения   мРНК   через   рибосому)   в   ее аминоацильном центре. А это,  приводит к завершению синтеза белковой молекулы. Код белкового синтеза Пер код вая она У ц Вторая буква Треть я кодона кодон У Ц А г а тир цис У фе сер н . сер тир цис ц фе н леи сер А леи сер три Г лей про гис арг У лей про гис арг ц леи про глн арг А ■ лей про глн арг Г А Перва Вторая буква  кодона я кодона У Ц А г иле тре асн сер иле тре асн сер иле тре лиз арг мет тре лиз арг вал ала асп гли вал ала асп гли вал ала глу гли вал '  глу гли Г Третья кодона У ц А Г У Ц А Г Изучение   свойств   кода   белкового   синтеза   показало,   что  он  является   триплетным, непрерывным, неперекрывающимся, вырожденным и универсальным. ала В последнее время накопились факты, доказывающие, что существенное значение для кодирования имеют лишь два из трех нуклеотидных остатков в кодоне (У. Лагерквист, 1978). Существуют   семейства   кодонов,   отличающиеся   только   третьей   буквой—именно   она распознается   в   ряде   случаев   неоднозначно.  Таким   образом,   код   белкового   синтеза,   по существу, является квазидуплетным (условно, мни­модуплетным). Непрерывность кода белкового синтеза состоит в том, что все входящие в его состав кодоны   располагаются   в   мРНК,   кодирующей   биосинтез   определенного   белка,   в   строгом порядке   один   возле   другого,   не   будучи   разделенными   моно­   или   олигонуклеотидными вставками. Неперекрывающийся характер кода белкового синтеза заключается в том, что ни один из нуклеотидов одного кодона не является составной частью другого (соседнего) кодона. Вырожденность кода сводится к его множественности для тех или иных аминокислот. Из   табл.   видно,   что   вступление   в   полипептидную   цепь   как   лейцина,   так   и   аргинина обеспечивается   шестью   различными   кодонами;   подавляющего   большинства   других аминокислот—четырьмя   или   двумя   кодонами   и   лишь   в   одиночных   случаях   (метионин   и триптофан)—одним кодоном. Естественно, что вследствие вырожденности кода существуют соответствующие   наборы   тРНК,   взаимодействующих  с  комплектом   кодонов   для   данной аминокислоты. Универсальность  кода белкового синтеза определяется тем, что он един для всего живого   на   земле:   от   простейшего   фага   или   бактерии   до   венца   творения—человека   и неизменен уже более 3 млрд. лет. Однако код белкового синтеза в митохондриях существенно отличается от такового прокариот и эукариот и его происхождение остается загадкой. К тому 5 же у реснитчатых и микоплазм он тоже отличается от канонического: терминирующие кодоны у них выполняют кодирующую функцию. Всегда ли кодирование осуществляется с абсолютной точностью или возможно ложное кодирование   и   включение   аминокислоты   в   полипептидную   цепь   не   в   соответствии   со структурой   кодона?   Считают,   что   определенный   уровень   ложного   кодирования запрограммирован эволюционно и в тех случаях, когда вследствие мутации изменен один из кодонов в мРНК, он может транслироваться как неизменённый («ложь во спасение»). Это помогает клеткам, в том числе и бактериальным, выжить при неблагоприятных мутациях.  Вопросы ложного кодирования  в процессе  белкового синтеза успешно изучаются в Институте белка в Пущино под руководством акад. А. С. Спирина. Проблема кодирования биосинтеза белков в последние годы обсуждается еще в одном принципиальном   аспекте.   Исходя   из   работ,   в   которых   удалось   доказать   способность некоторых   белков   без   участия   нуклеиновых   кислот   обеспечивать   собственное мультиплицирование,   накопление   и   реализацию   присущего   им   патологического (инфекционного) процесса, В. А. Кордюмом выдвинута концепция о существовании новой формы   биологической   информации—пространственной   структуры   белка,   способной   к самовоспроизведению. 6