Рекомбинантные антитела. Технологии получения

Тема: Рекомбинантные антитела. Технологии получения.

   Рекомбинантные антитела существенно отличаются не только по структуре, но и по функциональным характеристикам. Различают химерные, гуманизированные, конъюгированные; двуцепочечные и одноцепочечные или мини-антитела.

   Химерные антитела (или гибридные) – это антитела, в которых константный домен мышиных антител замещен соответствующим константным доменом иммуноглобулина человека. При помощи рекомбинантной технологии соединяются разнородные молекулы ДНК, кодирующие человеческий Fc-фрагмент и мышиный  Fab-фрагменты антитела. Поскольку иммуногенные и эффекторные свойства антител определяются константным доменом, а специфичность взаимодействия с антигеном определяется вариабельным доменом, то химерные антитела более эффективны и вызывают значительно меньше осложнений при сохранении специфичности, аффинности и авидности, свойственных мышиным моноклональным антителам.

   Гуманизированные антитела.  В структуре гуманизированных антител мышиное происхождение имеют только  небольшие антигенсвязывающие гипервариабельные участки (CDR) вариабельного домена – Fv – фрагмента. Если у химерных антител вариабельный домен полностью является мышиным, то у гуманизированных – только его часть животного (мышиного) происхождения. Fv-фрагмент состоит их трех  CDR участков (CDRI, CDRII, CDRIII).  С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляют последовательную замену только одного или двух CDR участков ДНК человека на соответствующий CDR участок ДНК мыши. Таким образом, гуманизированные антитела содержат еще меньше чужеродного белка, т.е. только CDR – мышиного происхождения.  Поэтому вероятность иммунного отторжения значительно ниже.

   Одноцепочечные антитела. Наряду с полноразмерными химерными и гуманизированными антителами генная инженерия позволяет получать и одноцепочечные, мини-антитела, состоящие только из участков Fv –фрагмента (scFv). Это вариабельные домены легких и тяжелых цепей -   Vl и  Vh иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пептидным линкером. Константные домены исходного мышиного антитела полностью отсутствуют.  Такие одноцепочечные мини-антитела представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобулина, который обладает хорошей антигенсвязывающей активностью.    Конъюгированные антитела. К моноклональным антителам присоединяют лекарственные соединения (цитостатики, токсины и др.) или диагностические метки (радиоактивные частицы, флуоресцирующие вещества) с целью адресной доставки к клеткам-мишеням либо с целью детекции. Моноклональные антитела, конъюгированные с токсинами, называют иммунотоксинами.

   Технологии рекомбинантной ДНК.  Для получения рекомбинантных антител с разной специфичностью, с различными гипервариабельными участками в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и  Fv-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов  E.coli – это метод фагового дисплея.  Для этого, используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоциты) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией).  Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н и L – цепи. Амплифицированные  кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага.  кДНК  Н и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н и L-цепей.  кДНК, кодирующие Н и L-цепи  Fv-фрагмента встраивают в вектор, в геном бактериофага.  Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отбираются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный  связываться со специфическим антигеном.  Рекомбинантные антитела  экспонируются на поверхности репродуцировавшихся модифицированных нитевидных бактериофагов. При этом, каждый фаг несет один вариант антител. Далее эти антитела, гены которых закодированы в ДНК бактериофага-вектора, отбираются in vitro по способности взаимодействовать  с антигеном.  

   Таким образом, создание рекомбинантных антител нужной специфичности начинается с получения библиотеки клонов ДНК, встроенных  в соответствующее число бактериофагов.  Затем проводится биопаннинг – селекция бактериофагов, обладающих  большей аффинностью к иммобилизованным лигандам (специфическим антигенам).  Биопаннингом или аффинной селекцией можно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антител нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать фаги, несущие гены, кодирующие синтез мини-антител с нужными свойствами. Число клонов ДНК в составе одной фаговой библиотеки, созданной технологией фагового дисплея способно кодировать синтез разной специфичности антител, соизмеримых с их разнообразием в организме млекопитающего.

   С целью продукции рекомбинантных антител, модифицированную кДНК встраивают в векторы экспрессии и трансформируют  ими подходящие клетки-хозяева, чаще E.coli или клетки млекопитающих.