Инсулин. Получение инсулина на основе методов генетической инженерии

    Тема: Интерфероны. Получение интерферонов.

   Интерфероны были открыты в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать здоровым клеткам устойчивость к вирусной инфекции: он как бы препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и в силу этой способности был назван интерфероном.  Существует три разновидности интерферонов:  α, β, относимые к первому классу,  γ-интерферон, относимый к второму классу.    

   Интерферон-α, продуцируемый лейкоцитами, обладает преимущественно противовирусным, антипролиферативным и противоопухолевым действием.  

   Интерферон-β, образуемый фибробластами, обладает преимущественно противоопухолевым , а также антивирусным действием. 

   Интерферон –γ – продуцируются  Т-лимфоцитами и естественными киллерами (NΚклетками) и называется лимфоцитарным и иммунным. Он обладает преимущественно иммуномодулирующим и слабым противовирусным эффектом.   

   Продукцию интерферонов Ι класса индуцируют вирусы, двухцепочечные РНК, синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды, продукцию  интерферона – γ – вирусные и бактериальные антигены или антисыворотки против поверхностных детерминант лимфоцитов.  Противовирусный эффект интерферонов обусловлен способностью активировать в клетках синтез  двух ферментов – олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы, ингибирующих биосинтез белка и размножение вируса в инфицированной клетке, что вызывает ее лизис. Таков же механизм антипролиферативного  противоопухолевого действия интерферонов.      Интерферон-γ – полифункциональный иммуномодулирующий лимфокин, влияющий на рост и дифференцировку клеток разных типов. Он активирует макрофаги на этапе передачи антигенной информации лимфоциту, повышает их антимикробную и противоопухолевую активность, продукцию ИЛ-1.  ИФ-γ активирует естественные киллеры, цитотоксические лимфоциты, подавляющие рост опухолей.   

   Интерфероны-α являются протеинами, а β и γ – интерфероны – гликопротеинами, они представляют собой типичные глобулярные белки. В α – интерферонах обнаружены две дисульфидные связи. Интерфероны – низкомолекулярные белки из 146-166 аминокислотных остатков, видоспецифичны, т.е. человеческий интерферон биологически активен в организме человека, мышиный – только в организме мыши. 

   К числу наиболее хорошо исследованных интерферонов относятся α-интерфероны; число генов, их кодирующих примерно 20, они локализованы в 9-й хромосоме.  В отношении βинтерферонов – выделен только один белок, соответствующий β-интерферону человека – интерферон β 1 – ему соответствует практически вся противовирусная активность. Не исключено, что в геноме существует ряд генов, кодирующих различные β – интерфероны.  Гены β – интерферонов локализованы в 9-й хромосоме.   Интерферон-γ представлен всего одним индивидуальным белком, который кодируется одним геном, расположенным в 12-й хромосоме. 

   Получение интерферонов. Интерфероны служат одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но они видоспецифичны и могут быть получены только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна, прежде всего, из-за крайне малого выхода конечного продукта (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т.е. примерно одну дозу для инъекции).

  На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. кДНК полученные обратным транскрибированием, были клонированы в  E.coli.  Ген интерферона был встроен в векторную ДНК, и к нему были присоединены бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке.  Сначала интерфероны в клетке синтезируются в виде предшественников, содержащих  на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате чего образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того, чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена , которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Данная процедура осуществлялась следующим образом. Ген интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau 3А1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Триплет АТG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован небольшой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет  АТG – точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, и в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК. Экстракты из   E.coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью. Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен и его физико-химические свойства оказались близкими свойствами интерферона, полученного из крови доноров.  Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1л бактериальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1л крови доноров.

    При использовании генно-инженерных технологий в разных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирующих различные интерфероны: α-, β- и γ- типов. Недостаток  использования  E.coli для получения β- и γ-интерферонов – отсутствие в бактерии аппарата гликолизирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликолизированных молекул. И хотя роль гликолизирования неясна и негликолизированные β- и γ-интерфероны практически полностью сохраняют противовирусную активность, эта особенность диктует осторожный подход к использованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике. 

   В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликолизирование.  В 1981 году в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae.  Полученная эффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.

   Интерфероны выпускают в качестве лекарственных препаратов в виде каплей в нос, мазей и растворов для инъекций. Существуют натуральные интерфероны, полученные из лимфоцитов донорской крови и искусственно синтезированные с применением генно-инженерных технологий (рекомбинантные).  В настоящее время в России и за рубежом выпускают коммерческие препараты – человеческий лейкоцитарный, лимфобластный (Велферон) и фибробластный (Ферон), а также интерфероны, полученные генно-инженерными методами: рекомбинантные α-интерферон (Роферон, Реальдерон и др.), β-интерферон и γ-интерферон

(Гаммаферон).