Интерфероны. Получение интерферонов.

   Тема: Инсулин. Получение инсулина на основе методов генетической инженерии

   Историческая справка.  В 1869 году в Берлине 22-летний студент-медик П.Лангерганс, изучая строение поджелудочной железы , обратил внимание на ранее не известные клетки, образующие группы, которые были равномерно распределены по всей железе. В последующем они были названы в честь него «островки Лангерганса».  В 1901 году было установлено, что сахарный диабет обусловлен разрушением этих «островков» в поджелудочной железе. 

   Островки Лангерганса образованы α и β клетками, α- клетки вырабатывают гормон глюкагон, способствующий превращению гликогена печени в глюкозу крови, в результате чего увеличивается уровень сахара в крови, в β-клетках вырабатывается инсулин. Инсулин повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, что способствует ее расщеплению тканями, отложению гликогена и уменьшению количества сахара в крови. При недостаточности функции поджелудочной железы развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет. 

   Первичная структура, т.е. точная последовательность расположения аминокислот, образующих молекулу инсулина впервые определена Фредериком Сэнгером (1949–1954 гг

   Первые препараты инсулина животного происхождения. С 1922 года свиной и бычий инсулин применялся как лечебный препарат при диабете. Технология заключалась в экстрагировании белка – инсулина из поджелудочной железы. При этом, для получения 100 грамм кристаллического инсулина необходимо было 800-1000 кг исходного сырья.

   По природе инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.  Синтез инсулина в поджелудочной железе происходит следующим образом.  В клетках Лангерганса на рибосомах ЭПР  синтезируется  пептидпредшественник – препроинсулин. Он представляет собой полипептидную цепь, построенную из 110 аминокислотных остатков и включает в себя расположенные последовательно:  Сппептид – сигнальный пептид из 24 аминокислот, А-пептид из 21 аминокислотного остатка, Спептид (соединительный) из 35 аминокислот и В-пептид из 30 аминокислотных остатков. 

   Препроинсулин:   Сп -------А --------С--------В;

   После синтеза в ЭПР от этой молекулы отщепляется сигнальный (Сп) пептид – последовательность из 24 аминокислот, которые необходимы для прохождения синтезируемой молекулы через гидрофобную липидную мембрану ЭПР. Образуется  проинсулин, который транспортируется в комплекс Гольджи, где происходит частичный протеолиз – из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается Спептид – фрагмент из 35 аминокислот, обеспечивающий необходимую ориентацию А и В цепей и соединяющий их  дисульфидными связями.  В секреторных  гранулах инсулин, соединяясь с ионами цинка, образует кристаллические гексамерные агрегаты. Это белок из 51 аминокислотного остатка, состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных дисульфидными мостиками.  Таким образом, в β-клетках островков Лангерганса в результате процессинга из препроинсулина образуется проинсулин и затем инсулин.

   В настоящее время используются препараты человеческого инсулина, полученные генноинженерной технологией при помощи рекомбинантных штаммов бактерий – E.coli и др.    Предварительно химическим путем раздельно синтезируются две нуклеотидные последовательности – кДНК, кодирующие А цепь и В цепь.  Затем эти последовательности нуклеотидов  встраиваются в LacZ ген E.coli, кодирующий часть молекулы фермента бетагалактозидазы,  LacZ ген находится в составе pBR322 плазмиды. Каждую из плазмид с LacZ геном и А или В цепью вводят в отдельный штамм   E.coli. В этих фрагментах кДНК нет нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные (Сп) и соединительные (С) пептиды.   Генетически модифицированные  E.coli раздельно культивируют в двух биореакторах, затем выделяют из культуральной жидкости химерные белки, состоящие из ковалентно связанных молекул рекомбинантного белка (А и В цепи) и собственного белка эшерихий. Выделив химерные белки, их обрабатывают бромцианом, разъединяющим белки по остаткам метионина. Далее А и В цепи отделяются от белков фермента бета-галактозидазы и очищаются. Очищенные А и В цепи  соединяются химическим путем дисульфидными связями и получают чистый, биологически активный мономер  инсулина. 

   Инсулин стал первым препаратом, созданным с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время именно такой инсулин широко применяется в медицинской практике. 

   Тема: Интерлейкины. Получение рекомбинантного человеческого интерлейкина.    Цитокины - низкомолекулярные гормоноподобные медиаторы, продуцируемые разными клетками организма и способные влиять на функции других или этих же групп клеток. Цитокины – пептиды или гликопротеиды, действующие как аутокринные, паракринные или межсистемные сигналы. Цитокины формируются как активированными или поврежденными, так и клетками без дополнительной стимуляции. Регуляторами продукции цитокинов могут быть другие цитокины, гормоны, простагландины, антигены и многие другие агенты, воздействующие на клетку. 

Различают несколько групп цитокинов: 

–    группа интерлейкинов; 

-                     группа факторов роста (эпидермальный, фактор роста нервов), колониестимулирующие факторы, хемотаксические факторы;

-                     цитотоксины или цитокины группы фактора некроза опухолей; -  интерфероны.

    Группа интерлейкинов включает более 20 цитокинов, большинство из которых играет ключевую роль в развитии специфического иммунного ответа.

    Продукция ИЛ-1 осуществляется преимущественно моноцитами и макрофагами.  Синтез ИЛ1 начинается в ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей и запускает комплекс защитных реакций, составляющих первую линию обороны организма. Одно из главных свойств ИЛ-1, заключается в способности стимулировать функции и увеличивать число лейкоцитов.  ИЛ-1 обусловливает  пролиферацию лимфоцитов при индукции иммунного ответа, а также активирует  Т-лимфоциты, увеличивает продукцию антител.  Этот цитокин – эндогенный пироген, вызывающий лихорадку за счет воздействия на гипоталамический центр терморегуляции.

   Интерлейкин – 2 - ИЛ-2 обладает относительно узким спектром мишеней и объектов: Т- и В-лимфоциты, NK-клетки. Является для них фактором роста и дифференцировки. ИЛ-2 способствует реализации функции Т-хелперов, усиливая выработку гамма - интерферона, препятствует развитию иммунологической толерантности, способен ее отменять. ИЛ-2 служит ростовым и дифференцировочным фактором для Т-киллеров. На В-лимфоциты ИЛ-2 действует как один из ростовых факторов, может повышать синтез IgM, IgG, IgA. ИЛ-2 при воздействии на NK-клетки увеличивает их цитотоксическую активность и расширяет спектр их цитотоксического действия. ИЛ-2 воздействует также на моноциты, усиливая генерацию активных форм кислорода и перекисей, а также на процесс кроветворения. Он повышает образование эозинофилов и тромбоцитов, но подавляет миелоидный и эритроидный ростки кроветворения, способствует развитию экстрамедуллярных очагов гемопоэза. 

   Производство человеческого интерлейкина основано на технологии рекомбинантной ДНК. Ген человеческого интерлейкина встраивается в плазмидный вектор и трансформируется  в бактериальные  клетки E.coli  либо в дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae. Плазмидная конструкция, трансформированная в дрожжевые клетки содержит ген человеческого ИЛ-2 и фрагмент ДНК маркерного пептида, кодирующие синтез химерного белка. Химерный белок стабилизирует и защищает человеческий белок от внутриклеточного расщепления.  Технология ферментации данных продуцентов (Saccharomyces cerevisiae) и технология очистки с применением оригинальных сорбентов и выделение ИЛ2 методом аффинной хроматографии   отработаны и осуществляются на предприятиях, укомплектованных соответствующим оборудованием.  

   В медицинской практике интерлейкин 1, 2 применяются при лечении врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний, хронических вирусных гепатитов, гнойносептических хирургических инфекциях.  Однако, лечение сопряжено с высокой токсичностью препаратов, что  ограничивает его широкое  применение наряду с крайне высокой стоимостью.