Получение витаминов группы В.

   Тема: Витамины. Получение витаминов группы В.

   План:   1. Характеристика и определение витаминов, функции витаминов.

2.  Микробиологический синтез витамина В_{12 .}

3.  Получение витамина В₂ .

4.  Использование витаминов В₁₂ , В₂ в медицине и животноводстве. 

Ключевые слова:  цианкобаламин, рибофлавин, пропионовокислые бактерии, плесневые грибы.

   Витамины – это низкомолекулярные органические вещества, необходимые любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток витаминов нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в частности, растения. Многие микроорганизмы также образуют целый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основой для разработки технологий промышленного производства.  Однако, с помощью микроорганизмов целесообразнее производить особо сложные по строению витамины: В₁₂ , В₂ , β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D.  В производстве большинства витаминов ведущие позиции занимает химический процесс. 

   Получение витамина В₁₂. Витамин В₁₂ – α- 5,6-диметилбензимидазол (ДМБ) – цианкобаламин необходим для роста и развития многих животных и микроорганизмов. Способность к его синтезу широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин   В₁₂ Propionibacterium, а также   Pseudomonas  и смешанные культуры метанообразующих бактерий. 

   Микробиологический синтез – единственный способ получения витамина В_{12 –} осуществляют в две стадии на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу коэнзима В₁₂ – аденозилкобаламина 5,6 ДМБ.  Первую стадию культивирования проводят в течение 80 часов в анаэробных условиях и при слабом перемешивании (до полной утилизации сахара).  Полученную биомассу центрифугируют и сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение 88 часов, аэрируя культуру воздухом 2 м³ /ч.  Питательная среда содержит сахара (обычно глюкозу, 1-10%), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10-100 мг/л), кукурузный экстракт (37%) и азот в виде (NH₄)₂ SO₄ . Ферментацию проводят при 30⁰ С и рН 6,5-7,0. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения ферментации витамин извлекают из клеток нагреванием в течение 10-30 минут при 80-120⁰С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом происходит образование CN-кобаламина. Продукт сорбируют , пропуская раствор через активированный уголь и окислы алюминия, а затем элюируют водным спиртом или хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин В₁₂ , выход которого достигает 40мг/л.

   Разработаны эффективные технологии получения витамина В₁₂  и на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, которые выращивают в нестерильных условиях в течение 18 часов при 65-75⁰ С на питательных средах, приготовленных из соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Выход витамина составляет от 2,0 до 6,0 мг/л.

   Для нужд живодноводства витамин В₁₂ получают на основе смешанной ассоциации, состоящей из четырех культур – углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфатвосстанавливающих и собственно метанообразующих бактерий, которые взаимосвязанно расщепляют органический субстратдо СО₂  и СН₄ . В качестве субстрата используют декантированную ацетоно-бутиловую барду, содержащую 2,0-2,5% сухих веществ. Брожение проходит при 55-57⁰ С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй – метан, углекислота и витамин В₁₂. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2,5-3,5 суток, в двух последовательно – 2-2,5 суток. Концентрация витамина в барде достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах образуется газ – 65% метана и 30% углекислоты. Барда имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20% содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В₁₂ в сухом препарате составляет 100 мкг/г.  

   Получение витамина В₂ . Название витамина В₂  - рибофлавин – происходит от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита.  Он широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами, бактериями.

   Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его в составе комбикормов, поскольку при его дефиците в организме нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний. 

   Рибофлавин, или витамин В₂  - содержится в клетках  микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего - соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз - ФМН, ФАД).   Продуцентами витамина В₂  являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes,  Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, Candida flaveri),  микроскопические грибы (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые  (Aspergillus niger) грибы.

   Промышленное получение рибофлавина осуществляют химическим, микробиологическим и комбинированным синтезом.  При комбинированном – синтезированная  микроорганизмами рибоза химически трансформируется в витамин В₂ .    Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе гриба  Aspergillus.  Для высоких выходов витамина (до 7г/л) используют  усовершенствованные штаммы и оптимизированные среды, содержащие в %: кукурузный экстракт – 2,25; пептон – 3,5; соевое масло – 4,5 и стимуляторы (пептоны, глицин).  Используют активный инокулят, которым засевают стерильную среду. Ферментацию проводят в течение семи суток при 28⁰ С и хорошей аэрации.  Исходный рН составляет 7,0, в ходе ферментации в связи с выделением кислот среда подкисляется до рН 4,0-4,5.  После использования углеродного субстрата продуцент начинает утилизировать кислоты, рН повышается, и затем начинается образование витамина В₂ . При этом, кристаллы рибофлавина накапливаются в гифах и вне мицелия.  На постферментационной стадии для выделения витамина мицелий нагревают  в течение 1 часа при 120⁰ С.

   Для получения кормовых препаратов витамина В₂  используют достаточно простой способ, основанный на выращивании микроскопического гриба  Eremothecium ashbyii в глубинной культуре в течение 80-84 часов при 28-30⁰ С на среде с глюкозой или мальтозой (2,5%), источником азота в виде NH₄ NO₃  и карбоксидом кальция (0,5%).  Выход  рибофлавина составляет 1250мкг/мл.  Культуральная жидкость концентрируется в вакуумном испарителе до содержания сухих веществ  30-40% и высушивается в распылительной сушилке.  Товарная форма продукта  -  порошок с содержанием рибофлавина не менее 10мг/г и 20% сырого протеина.  В препарате присутствуют  также никотиновая кислота(витамин РР) и витамины В_{1 ,}  В₃ , В₆ , В₁₂.   

     Использованная литература:

1.      Медицинская биотехнология.  К.Х.Алмагамбетов.  // Астана. – 2009. – 236с.

2.      Молекулярная биотехнология. Б. Глик,  Дж.Пастернак. // Москва «Мир». – 2002. – 589с.

3.      Биотехнология. Н.В.Загоскина, Л.В.Назаренко и др. //  Москва. – «Оникс». – 2009. – 496с.

4.      Основы биотехнологии.  Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина.  //  Москва. –

«Академия». – 2008. – 208с.

     Контрольные вопросы:

1.      Характеристика  витаминов.

2.      Характеристика витамина В_12.   

3.      Характеристика витамина В_2.   

4.      Характеристика микроорганизмов, синтезирующих витамины. 

5.      Микробиологический синтез витамина В_12.

6.      Микробиологический синтез витамина В_2.

7.      Характеристика химического и комбинированного синтеза витамина  В₂  и  В_12.

8.      Способы получения кормовых препаратов витамина В₂  и В_12..  

9.      Получение витамина В₂  использованием  рекомбинантного штамма продуцента

Bacillus subtilis.  10. Применение витаминов В₂  и  В₁₂  в медицинской практике.