Получение β-каротина (провитамин А) и витамина D2

   Тема: Получение β-каротина (провитамин А) и витамина D2 

 Витамины – низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в клетке в малых количествах и обладающие биологической активностью. Биологическая активность витаминов определяется тем, что они входят в состав активных центров ферментов в качестве кофакторов.  Поэтому недостаток витаминов понижает биокаталитическую активность ферментов, влияет на обменные процессы, рост и развитие организма.  Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.  Все водорастворимые и жирорастворимый витамин К являются коферментами биохимических реакций. Витамины А, D, Е участвуют в регуляции генетического аппарата клетки.  Потребность взрослого организма в витаминах (в зависимости от вида) составляет от нескольких мкг до десятков мг в сутки.  Водорастворимые  витамины в организме не накапливаются, кроме В12 , поэтому необходимо их ежедневное поступление. Жирорастворимые витамины накапливаются в тканях (это индукторы синтеза белков, структурные компоненты клеточных мембран).

   В естественных условиях биосинтез витаминов осуществляют растения и микроорганизмы. Однако, при обработке растительной пищи наблюдается потеря витаминов, к примеру, при получении муки  высшего сорта теряется 80-90% витаминов.      

   Витамин А - циклический, непредельный одноатомный спирт, образуемый в слизистой кишечника и печени из провитаминов: α-, β-, γ-каротинов под воздействием фермента каротиноксидазы. Наибольшей активностью обладает βкаротин, так как образует две молекулы ретинола; другие -  только одну.  Каротиноиды - широко распространенная группа природных пигментов, образуемых высшими растениями, водорослями и некоторыми микроорганизмами. В организме человека и животных каротины не образуются.  Основные источники βкаротина  для животных – растительные корма, человек получает  β-каротин также  из продуктов животного происхождения.  β-Каротин можно получить  из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны.    

   В начале 60-х годов  ХХ века разработана схема микробиологического синтеза βкаротина, которая стала основой  промышленного способа его получения.  Среди микроорганизмов β-каротин синтезируют  фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи.  При этом, содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание  этого провитамина у растений.  Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы мицелиального  гриба  Blakeslea trispora – 3-8 тыс.мкг.   

   Микробиологический синтез основан на использовании  Blakeslea trispora, в качестве субстрата применяется пшеничная или рисовая мука, растительное масло (хлопковое, кукурузное или подсолнечное).  Вносятся стимуляторы синтеза  βкаротина В-ионон или цитрусовая меласса,  тиамин, а также  свет, обладающий стимулирующим эффектом.

   Вначале (+) женские и (-) мужские штаммы мицелия  выращивают раздельно.   Затем их смешивают в биореакторе, непосредственно перед ферментацией. Соотношение (+) и (-) штаммов должно быть 1/15, т.е. мужские штаммы должны преобладать в 15 раз. При слиянии разнополого женского (+) и мужского (-) мицелия образуется зигота, которая синтезирует в 5-17 раз больше бета-каротина, чем каждый штамм в отдельности. Ферментация сопровождается аэрацией и перемешиванием. Длительность ферментации - 6-7 дней.    Накопление бетакаротина наблюдается  во второй фазе развития, после прекращения роста мицелия.

В культуральной среде уменьшается концентрация липидов вследствие их активной переработки в бета-каротин. Концентрация бета-каротина достигает 2000мг/л.

   По окончании ферментации биомасса сепарируется, подвергается распылительной сушке до 7% остаточной влаги. Далее в зависимости от назначения, цели применения используются различные технологии:

-                     если необходим в качестве кормового концентрата – после сушки порошок смешивается с наполнителем и гранулируется;

-                     для применения в качестве пищевой добавки – экстрагируется маслом, концентрируется, промывается этанолом. В результате получают каротин  в масле  (подсолнечное или другое)  с содержанием  2,0-2,5 г/кг провитамина.  Используется  как пищевая добавка к хлебу, маслу;

-                     для медицинских целей – экстрагируют фреоном, очищают от органических примесей и получают кристаллы оранжево-красного цвета.  Выпускается в капсулах для приема через рот.        Витамин D (кальциферол)

   Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Различают два родственных соединения жирорастворимого витамина   D – D2  и D3 .  D2  - эргокальциферол (кальциферол - в переводе «несущий кальций») получают путем облучения эргостерина ультрафиолетовыми лучами.  

D3  - холекальциферол образуется из 7-дегидрохолестерина.  В организме человека и животных кальциферол регулирует усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани.    

    В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФоблучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5--10% эргостерина.

   В качестве промышленного источника эргостерина используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вследствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования происходит накопление в клетках дрожжей сквалена (предшественника эргостерина). Индукция синтеза эргостерина начинается при строго определенной концентрации кислорода от 0,03 до 2%. При этом среда должна содержать избыток углеводов и малое количество азота. По окончании процесса спиртового брожения дрожжи отделяют от барды и вносят в питательную среду необходимое количество источников углерода, азота и фосфора. Ферментацию ведут в аэробных условиях 12 -- 20 часов, по окончании которой клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости, добавляют антиоксиданты и сушат. Обычно в такой биомассе содержание эргостерина достигает 1,5%.  Полученную биомассу гидролизуют раствором соляной кислоты, затем очищают спиртом, концентрируют и облучают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 280-300 нм. Это излучение возбуждает отдельные химические связи в углеродных циклах и вызывает превращение эргостерина в  витамин D2 . 

   Для получения масляной формы витамин после фильтрации растворяют в растительном масле и используют как пищевую добавку. 

   Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи подвергают  кислотному гидролизу при 1100 С. Витамин D2  экстрагируют спиртом, фильтруют, фильтрат упаривают  и несколько раз промывают спиртом. Спиртовой экстракт сгущают до 50%-й концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Образовавшиеся кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире, отгоняя последний. Кристаллический осадок растворяют в масле . Препарат используют  в медицинских целях.  Эргостерин служит также исходным продуктом для получения ряда стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.

   Тема: Витамины. Получение витаминов группы В.

 Получение витамина В12. Витамин В12 – α- 5,6-диметилбензимидазол (ДМБ) – цианкобаламин необходим для роста и развития многих животных и микроорганизмов. Способность к его синтезу широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин   В12 Propionibacterium, а также   Pseudomonas  и смешанные культуры метанообразующих бактерий. 

   Микробиологический синтез – единственный способ получения витамина В12 – осуществляют в две стадии на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу коэнзима В12 – аденозилкобаламина 5,6 ДМБ.  Первую стадию культивирования проводят в течение 80 часов в анаэробных условиях и при слабом перемешивании (до полной утилизации сахара).  Полученную биомассу центрифугируют и сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение 88 часов, аэрируя культуру воздухом 2 м3 /ч.  Питательная среда содержит сахара (обычно глюкозу, 1-10%), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10-100 мг/л), кукурузный экстракт (3-7%) и азот в виде (NH4)2 SO4 . Ферментацию проводят при 300 С и рН 6,5-7,0. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения ферментации витамин извлекают из клеток нагреванием в течение 10-30 минут при 80-1200С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом происходит образование CN-кобаламина. Продукт сорбируют , пропуская раствор через активированный уголь и окислы алюминия, а затем элюируют водным спиртом или хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин В12 , выход которого достигает 40мг/л.

   Разработаны эффективные технологии получения витамина В12  и на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, которые выращивают в нестерильных условиях в течение 18 часов при 65-750 С на питательных средах, приготовленных из соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Выход витамина составляет от 2,0 до 6,0 мг/л.

   Для нужд живодноводства витамин В12 получают на основе смешанной ассоциации, состоящей из четырех культур – углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфатвосстанавливающих и собственно метанообразующих бактерий, которые взаимосвязанно расщепляют органический субстратдо СО2  и СН4 . В качестве субстрата используют декантированную ацетоно-бутиловую барду, содержащую 2,0-2,5% сухих веществ. Брожение проходит при 55-570 С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй – метан, углекислота и витамин В12. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2,5-3,5 суток, в двух последовательно – 2-2,5 суток. Концентрация витамина в барде достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах образуется газ – 65% метана и 30% углекислоты. Барда имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20% содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В12 в сухом препарате составляет 100 мкг/г.  

   Получение витамина В2 . Название витамина В2  - рибофлавин – происходит от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита.  Он широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами, бактериями.

   Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его в составе комбикормов, поскольку при его дефиците в организме нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний. 

   Рибофлавин, или витамин В2  - содержится в клетках  микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего - соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз - ФМН, ФАД).   Продуцентами витамина В2  являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes,  Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, Candida flaveri),  микроскопические грибы (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые  (Aspergillus niger) грибы.

   Промышленное получение рибофлавина осуществляют химическим, микробиологическим и комбинированным синтезом.  При комбинированном – синтезированная  микроорганизмами рибоза химически трансформируется в витамин В2 .

   Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе гриба  Aspergillus.  Для высоких выходов витамина (до 7г/л) используют  усовершенствованные штаммы и оптимизированные среды, содержащие в %: кукурузный экстракт – 2,25; пептон – 3,5; соевое масло – 4,5 и стимуляторы (пептоны, глицин).  Используют активный инокулят, которым засевают стерильную среду. Ферментацию проводят в течение семи суток при 280 С и хорошей аэрации.  Исходный рН составляет 7,0, в ходе ферментации в связи с выделением кислот среда подкисляется до рН 4,0-4,5.  После использования углеродного субстрата продуцент начинает утилизировать кислоты, рН повышается, и затем начинается образование витамина В2 . При этом, кристаллы рибофлавина накапливаются в гифах и вне мицелия.  На постферментационной стадии для выделения витамина мицелий нагревают  в течение 1 часа при 1200 С.

   Для получения кормовых препаратов витамина В2  используют достаточно простой способ, основанный на выращивании микроскопического гриба  Eremothecium ashbyii в глубинной культуре в течение 80-84 часов при 28-300 С на среде с глюкозой или мальтозой (2,5%), источником азота в виде NH4 NO3  и карбоксидом кальция (0,5%).  Выход  рибофлавина составляет 1250мкг/мл.  Культуральная жидкость концентрируется в вакуумном испарителе до содержания сухих веществ  30-40% и высушивается в распылительной сушилке.  Товарная форма продукта  -  порошок с содержанием рибофлавина не менее 10мг/г и 20% сырого протеина.  В препарате присутствуют  также никотиновая кислота(витамин РР) и витамины В1 ,  В3 , В6 , В12.