Изучение пигментов растений Разделение пигментов методом тонкослойной хроматографии

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА РАСТЕНИЙ  Изучение пигментов растений Разделение пигментов методом тонкослойной хроматографии  Оборудование и материалы: спиртовая вытяжка, химический стакан, капиллярная трубка, хроматографическая пластинка, колбочка со спиртом. ХОД РАБОТЫ 1. На хроматографической пластинке на расстоянии 1 см от основания проведите   простым   карандашом   стартовую   линию   (без   нажима,   чтобы   не повредить   хроматографический   слой).  С   помощью   микрокапилляра   на   эту линию   по   каплям   в   ряд   нанесите   спиртовую   вытяжку.   После   полного высыхания   процедуру   нанесения   спиртовой   вытяжки   повторите   8–10   раз. Далее   хроматографическую   пластинку   поместите   в   химический   стакан,   в который   предварительно   налейте   2   мл   спирта.   Стакан   накройте   чашкой Петри. Работа проводится до четкого разделения пигментов.  Определение числа хлоропластов, количества клеток и их обьема  в фотосинтезирующих тканях. Данные показатели определяются по методу А.Т. Мокроносова и Р.А. Борзенковой.  Пробы   для   измерений   отбираются   с   помощью   пробочных   сверл   с известным   диаметром.   При   этом   желательно   иметь   данные   о   собственном возрасте листа и площади листовой пластинки.  Учитывая   неоднородность   разных   участков   листа,   следует   отбирать пробы либо на определенном участке, либо брать средние пробы равномерно по всей поверхности листа. При   массовых   исследованиях   на   одном   объекте   рекомендуется предварительно   изучить   степень   структурной   гетерогенности   листовой пластинки.   Это   особенно   важно   для   листьев   однодольных   ­   очень неоднородных   по   длине.   Для   большинства   двудольных   растений   можно рекомендовать проводить оценку на средних участках листа, справа или слева от центральной жилки.  Подсчет   числа   клеток,   числа   хлоропластов   в   клетке,   определение размера клеток проводится на листьях, фиксированных в 70%­ном этаноле. В этом случае пробы могут храниться в холодильнике в течение 3­4 месяцев.   Количество   клеток   фотосинтезирующих   тканей   выражается   в тыс/см2..  Для определения числа клеток в единице площади, листья  фиксируют этанолом. Одна проба включает  5 дисков диаметром 9,8 мм   (сверло №4, общая площадь 3,8 см2). Подсчет числа клеток производят в суспензии после предварительной мацерации тканей.  Для   получения   суспензии,   в   пробирки   с   дисками   приливают   1   мл раствора HCl, затем помещают на водяную баню. Условия мацерации тканей подбирают для каждого объекта. Мацерация для подавляющего числа растений производится 0,5 ­1,0 н раствором HCl при 60 ­ 100°.  Некоторые объекты (например, осоки и злаки) требуют более жестких условий мацерации, и концентрация HCl может увеличиваться до 5,0 н. Время мацерации 10 ­ 30 мин.  Затем объем доводят водой до 5 мл и пробирку тщательно взбалтывают до   получения   однородной   суспензии.  Следует   иметь   в   виду,   что   слишком жесткие условия мацерации могут привести к разрушению клеток.  При работе с крупноклеточными объектами (картофель, свекла, табак, салат, и др.) подсчет клеток ведут в камере Фукса­Розенталя (V = 3,2 мм3). Если клетки мелкие и в суспензии их очень много (большинство древесных растений, злаки и др.), лучше использовать камеру Горяева (V = 0,9 мм3). Клетки   подсчитывают   по   всему   полю   камеры.   В   исключительных   случаях подсчет ведут в 0,5 ­ 0,25 поля камеры.  Самый   простой   подсчет   ­   определение   общего   количества   клеток   в камере  Он производитс  при отсутстви  дифференцировк  лист  на палисадну и губчатую ткани. Если лист дифференцирован, возможны следующие случаи. 1. На поперечном срезе листа видна резкая грань между палисадной и губчатой тканью, и клетки этих тканей отличаются по форме. В суспензии подсчитывают (отдельно) палисадные и губчатые клетки. Для проверки нужно подсчитать   общее   число   клеток.  Если   установлено,   что   сумма   губчатых   и палисадных клеток, полученная путем сложения, равна или близка к общей сумме клеток, полученной при подсчете, то в дальнейшем подсчет общего числа клеток можно не производить.  2.   Палисадная   и   губчатая   ткани   имеют   резкую   грань,   но   по   форме клетки   мало   отличаются   друг   от   друга.   В   суспензии   трудно   различить палисадные   и   губчатые   клетки.   В   этом   случае   на   поперечном   срезе определяют   количественное   соотношение   палисадных   (П)   и   губчатых   (Г) клеток. Затем в суспензии подсчитывают количество клеток. Зная отношение П/Г,   можно   определить   количество   палисадных   и   губчатых   клеток   в суспензии.  3.   Палисадная   и   губчатая   ткани   не   имеют   определенной   грани: палисадная ткань постепенно переходит в губчатую и, следовательно, имеется слой клеток, которые можно отнести и к палисадной, и к губчатой ткани. Здесь неизбежна условная граница между тканями или выделение третьего промежуточного слоя. Как во втором случае, определяют соотношение П/Г и вычисляют   количество   клеток   разных   тканей.   Следовательно,   прежде   чем приступить к мацерации, необходимо приготовить поперечный срез листа и тщательно изучить степень дифференцировки тканей. При подсчете клеток следует   учитывать   только   хлорофиллоносные   клетки   и   не   принимать   во внимание   клетки   эпидермиса,   волосков,   сосудисто­волокнистых   пучков   и других   тканей.   Если   условия   мацерации   ткани   выбраны   верно   и   получена однородная   суспензия,  то   подсчет   клеток     будет   зависеть   от   тщательного перемешивания   суспензии   перед   взятием   пробы   и   правильного   притирания стекла в камере. Анатомический анализ на многих видах растений показал, что   при   подсчете   клеток   в   камере   наиболее   часто   встречающийся коэффициент   вариации   (V%)   равен   20%.   За   счет   тщательности   работы наблюдателя коэффициент можно снизить до  10­15%.  Если   V%   =   20,   то   для   определения   среднего   значения   необходимо подсчитать   количество   клеток   не   менее   чем   в   16   камерах   при   заданной  = 0,99. ошибке (Sx %) 10%  при  Для     пересчета     количества   клеток   в   тыс./см2  нужно   умножить   среднее  = 0,95 и не менее чем в 27 камерах при  β β значение числа клеток в полном объеме  камеры   Фукса   –   на   коэффициент   К=     411,   камеры   Горяева   ­   на коэффициент К=1462. Эти коэффициенты справедливы для условий, когда проба листьев имеет площадь 3,8 см2 , а объем суспензии ­ 5 мл.  Объем   клеток   (тыс.   мкм3).   Суспензия   клеток   используется   для определения размеров клеток палисадной ткани, имеющих форму цилиндра или   эллипсоида.   Как   показывают   специальные   исследования,   мацерация фиксированной   этанолом   ткани   практически   не   влияет   на   размер   клеток. Например,   измерение   палисадных   клеток   табака   на   поперечном   и тангентальном   срезах  свежих листьев  дало  значение: L=117,6 мкм, D=34,7 мкм   (среднее   из   100   измерений).   Измеряя   клетки   в   суспензии   после мацерации, получили близкие значения: L=111,4 мкм, D =35,4 мкм.  Для   измерения   клеток,   каплю   суспензии   помещают   на   предметное стекло и осторожно закрывают покровным. На покровное стекло не давят. Палисадные   клетки   фотографируют   при   увеличении   15×10   или   15×20   (в зависимости   от   размера).   При   этом   же   увеличении   фотографируют   шкалу объект­микрометра.   Полученные   негативы   проектируют   на   экран фотоувеличителя   и   с   помощью   линейки   объект­микрометра   измеряют длинную (L) и короткую (D) оси клеток, включая клеточную оболочку. Объем клеток рассчитывается по формуле цилиндра:  LK r 2  π  = V,  где   К   ­   поправочный   коэффициент,   величина   которого   меняется   в зависимости от соотношения L/D.  Эти   коэффициенты   эмпирически   найдены   Ю.Л.   Цельникер   и   имеют следующие значения:  L/D  2,6    2,8   3,0   3,2     3,4     3,6   3,8       4,0     4,2   4,4    4,6    4,8    5,0  K    0,69  0,70  0,73  0,76  0,78   0,82   0,83   0,86   0,89  0,92  0,94  0,97  1,00 При   отношении L/D больше 5 поправочный коэффициент можно не вносить, так как клетка может быть принята за цилиндр. При отношении L/D меньше 2,5 объем клетки целесообразно  определять по формуле  эллипсоида вращения: Средний объем клеток можно рассчитывать двумя путями.  1. Определяется объем каждой отдельной клетки и затем вычисляется средний объем. Объем вычисляется по средним значениям L и D. Такой способ расчета проще, но ошибка найденного среднего объема клеток увеличивается, так как он   определяется   по   формуле   произведения   средних.   При   определении средних значений L и  D V% = 15 ­ 20.  Измеряя 50 ­ 100 клеток при V% = 15 ­20, имеем Sx % не более 5% при  = 0,95. Большую трудность вызывает измерение объема клеток в губчатой β ткани, так как у многих объектов эти клетки имеют неправильную форму. В этом   случае   возможны   два   решения,   которые   дают   лишь   приближенные значения объема клеток. 1. Делают и фотографируют тангентальный срез с нижней поверхности листа. Снимки проецируют на экран и определяют площадь контуров 50 ­ 100 клеток. Затем, пользуясь объект­микрометром, измеряют высоту клетки на поперечном   срезе.  Объем   определяют   по   произведению   площади   проекции клетки на высоту.   2. Получив серию снимков поперечных и тангентальных срезов листа, можно построить объемную модель клетки из пластилина в удобном масштабе и определить объем клетки по объему модели, используя при этом удельный вес   пластилина.   Этот   случай   оказывается   единственно   возможным     при необходимости   определить   объем   клетки   у   растений,   имеющих   очень сложную   амебообразную   форму   клеток   (например, папоротников). Ошибка измерений при этом значительна.    у   некоторых Определение числа хлоропластов в клетке Чаще   всего   при   мацерации   тканей   хлоропласты   в   клетке   сохраняют свою   целостность   и   можно   подсчитать   их   количество.   Если   число хлоропластов   в   клетке   невелико   (до   30),   подсчет   можно   производить   в нативной   клетке.   Если   хлоропластов   более   30,   непременным   условием является приготовление давленых препаратов. Каплю суспензии помещают на предметное   стекло   и   закрывают   покровным.   Небольшого   нажатия   на покровное стекло достаточно, чтобы хлоропласты в клетке распределились по плоскости. Клетка при этом изменяет свою форму, но при некотором навыке удается   различить   палисадные   и   губчатые   клетки.   Применение   давленых препаратов   повышает   скорость   и   точность   измерений   по   сравнению   с подсчетом   хлоропластов   в   целых   клетках.   На   давленых     препаратах обнаруживают на   30­50% больше пластид, чем в целых клетках. Подсчет хлоропластов у объектов с большим числом пластид (150 ­300) облегчается, если применять окулярную сетку. При подсчете хлоропластов нужно быть очень внимательным, так как за хлоропласты  можно  принять их  фрагменты. Разрушение   хлоропластов   иногда   происходит   во   время   приготовления   мацерации давленых   препаратов   или   при   мацерации,   если   условия   оказываются   слишком   жесткими,   а   также   при   длительном   хранении фиксированного   материала.   В   некоторых   случаях   наблюдается   плазмолиз клетки и агглютинация хлоропластов. Тогда подсчет хлоропластов ведут на свежем   материале   на   срезах.   Как   правило,   клетки   палисадной   и   губчатой ткани существенно отличаются по объему и по числу хлоропластов. Поэтому   число   хлоропластов   определяют   отдельно   в   тех   и   других клетках. В свою очередь среди палисадных и губчатых клеток вариация по размеру составляет, как указывалось, 15­20%, а в некоторых случаях может достигать 30­35%. Поэтому при определении средней величины количества хлоропластов в клетке нужно стремиться к тому, чтобы при подсчете в поле зрения микроскопа попадали разные по величине клетки. В противном случае можно получить искаженный результат.  Средний коэффициент вариации числа хлоропластов в клетке 25­30%.  = 0,95 Для определения среднего значения числа хлоропластов в клетке при  β и Sx % =10 нужно произвести подсчет не менее чем в 25 ­ 35 клетках, а при Sx % = 5 в 100 ­ 140 клетках.  Литература  1.  Мокроносов  А.Т.,  Борзенкова  Р.А.  Методика  количественной   оценки структуры и функциональной активности фотосинтезируемых тканей  и органов //  Труды  по  прикладной  ботанике,  генетике  и  селекции.  1978.   Т.61.  Вып.  3. С.119­133.    Получение альбиносных проростков ячменя (по Г.Н. Чупахиной)  Для  получения  альбиносных  проростков  ячменя  в  качестве   мутагена используется антибиотик стрептомицин, который ингибирует у бактерий 3OS­ субъединицы   7OS­рибосом,   в   результате   чего   появляются   ошибки   при считывании природной матрицы. Помимо бактерий 7OS­рибосомы содержат хлоропласты   растений,   поэтому   обработка   семян   ячменя   стрептомицином приводит   к   подавлению   синтеза   хлорофилла.   Из   обработанных   семян появляются проростки, первый лист которых имеет пигментированной только верхнюю   часть,   составляющую   не   более   четверти   от   всей     длины   листа. Между зеленым и альбиносным участками находится небольшая переходная   Семена   ячменя   обрабатываются   раствором желто­зеленая   зона. стрептомицина в концентрации 2,5 мг/мл. Семена помещаются в чашки Петри в   два   слоя   и   смачиваются   раствором   антибиотика.   Через   сутки   раствор впитывается  семенами,  поэтому  приливается  новая  порция стрептомицина. Возможна   другая   схема   обработки   семян:   первоначально   семена замачиваются в воде, а через сутки вода заменяется на раствор антибиотика. Семена выдерживаются в чашках Петри до прорастания, затем высаживаются в   почву.   Для   посева   используются   только   проклюнувшиеся   в   растворе   альбиносные стрептомицина   семена.   Экспериментально   полученные   проростки     используются   в   исследовательской   работе,   в     частности   при изучении светозависимых процессов. Изучение биологически активных веществ растений Фитонцидная активность  растений.  Биологический метод тестирования В концентрации 5мг/м3 летучие выделения растений способны изменять и   улучшать   воздушную   среду.   При   изучении   действия   летучих   выделений растений   (фитонцидов)   на   биологические   объекты   используется биологический метод тестирования ХОД РАБОТЫ Отдельные   растения   и   чашки   Петри,   с   высеянными   на   них микроорганизмами,   помещают   в   замкнутые   боксы   из   оргстекла.   Один   из боксов ­ контроль.  Для   оценки   фитонцидной   активности   растений   рассчитывается относительное   снижение   числа   микроорганизмов   в   опыте   по   сравнению   с контролем по формуле:  А = (К – О)/ К * 100%,   где К – число микроорганизмов в контроле;  О – количество микроорганизмов в опыте. Определение фитонцидной активности сока растений с использованием  простейших ХОД РАБОТЫ В   керамической   ступке   растереть   листья   хлорофитума   или   другого растения. Отжать через марлю несколько капель сока исследуемого растения. На   предметное   стекло   нанести   каплю   воды   из   аквариума   с   листом элодеи и поместить на предметный столик микроскопа  Просмотреть   препарат   сначала   под   малым,   а   затем   под   большим увеличением. Отметить  активность движения простейших в капле воды. Добавить   каплю   приготовленного   сока   из   листьев.   например хлорофитума, и соединить ее с каплей воды мостиком.  Наблюдать   за   движением   простейших.   С   помощью   секундомера отметить время (в минутах)  А)   нанесения   сока   или   кашицы   из   листьев   растения   на   предметное стекло; Б) замедления движения простейших В) гибели всех простейших. При оценке активности  летучих  фитонцидов растительная кашица из листьев   растений   наносится   на   предметное   стекло   рядом   с   каплей   с простейшими без соприкосновения. Методика работы с микроскопом – стандартная, увеличение в 120 раз.  Изучение биологически активных веществ растений Определение фенольных соединений При определении суммы фенольных соединений используется методика Левинталя в модификации А.Л. Курсанова. Оборудование, реактивы, материалы:  весы, водяная баня, ступки с пестиками, стаканчики на 100 мл, чашки испарительные на 800­1000мл или стаканы такого же объема, бюретки, колбы на 50 мл, раствор индигокармина (1г индигокармина растворяют в 5 мл концентрированной серной кислоты и доводят водой до 1 литра), 0,1н раствор  KMnO4  , дистиллированная вода, измельченный растительный материал. Ход работы: Навеску в 1–3г сухого перемолотого или 4 10г свежего растворенного в ступке с битым стеклом растительного материала нагревают в стаканчике на 100   мл   с   40   мл   дистиллированной   воды   в   течение   15   минут   на   кипящей водяной   бане   при   интенсивном   перемешивании.   Экстракт   охлаждают, фильтруют и доводят до метки в колбе на 50 мл. Часть полученного экстракта (10мл) переносят в фарфоровую чашку или стакан объемом 800­1000 мл, добавляют 750 мл дистиллированной воды и 25 мл раствора индигокармина. Смесь титруют 0,1 н раствором KMnO4  (3,16г перманганата   калия   в   1   литре   воды)   при   энергичном   перемешивании. Окончание титрования устанавливают  по появлению в растворе золотисто­ желтого   оттенка.   Результат   титрования   умножают   на   пересчетный коэффициент   для   перевода   миллилитров   0,1н  KMnO4    в   миллиграммы фенольных   соединений,   содержащихся   в   10мл   взятого   на   титрование экстракта. Для   большей   точности,   параллельно   проводят   контрольное тестирование, в котором 10 мл экстракта заменяют 10 мл дистиллированной воды и полученное значение вычисляют из основного определения. Расчет суммы фенольных соединений проводят по формуле: Х=n ,   где:                   (2) Т ­ количество титрующей жидкости, мл; n ­ пересчетный коэффициент на танин по методике принят равным 5,82 мг. Количественное определение витамина С методом йодиметрического титрования Оборудование и реактивы: химические пробирки, пипетки, стаканы на 150 мл, стеклянная воронка с ватой, коническая колба на 50­100 мл, рабочий раствор 0,003 н J2, раствор крахмала (0,5%), раствор соляной кислоты (2%). Подготовка   экстракта   из   пищевых   продуктов   для   определения витамина С. 2 г капусты (или картофеля, яблок, лимона и т.д.) натереть на терке в чашке Петри. Перенести измельченную массу в стаканчик и добавить 10 мл 2% раствора соляной кислоты. Тщательно перемешать и отфильтровать через стеклянную воронку с ватой в коническую колбу на 50­100 мл. Массу на фильтре промыть несколькими каплями воды. В фильтрат прилить 1 мл 0,5% раствора крахмала и титровать рабочим раствором 0,003 н  J2  до появления синего окрашивания. При расчете содержания витамина С в продукте использовать формулу определения массы при помощи титра по определяемому веществу:                                   М  . Эн 1000 )( гV где: н. – молярная концентрация эквивалента йода; Э ­   молярная концентрация эквивалента аскорбиновой кислоты в г, равная в данном случае 88 г; V – объем пошедшего на титрование йода, в мл. Полученный результат сравнить с табличными значениями содержания витамина С для использованного в работе материала.  Определение содержания свободных органических кислот и кислых солей в плодах методом титрования Органические кислоты содержатся в любой растительной ткани, хотя максимальное   их   количество   накапливается,   главным   образом,  в   плодах   и овощах.   Кислоты,   более   чем   какие­либо   другие   соединения,   определяют характерный вкус, присущий многим растительным продуктам, в частности плодам.   Количественное   содержание   органических   кислот   в   растениях подвергается   суточным   и   сезонным   изменениям.   Отличия   имеет   и качественный состав различных видов и сортов растений. В плодах и овощах содержатся самые разные органические кислоты, но обычно преобладает одна ­α из   них.   Так,   в   яблоках   обнаружены   яблочная,   янтарная,     лимонная,   кетоглутаровая, щавелевоуксусная, пировиноградная, уксусная, хлорогеновая и другие кислоты. Но около 70 % от их общего количества приходится на яблочную кислоту, до 20 % – на лимонную, около 7 % – янтарную и лишь 3 % – на остальные кислоты.  Для плодов и овощей, за редким исключением (например, виноград), характерно преобладание свободных органических кислот над связанными. В листьях они находятся, главным образом, в виде нейтральных и кислых солей, достигая 15–25 % на сухое вещество. Растворы солей органических кислот в смеси со свободными кислотами являются   буферными системами клетки, поддерживая  определенное значение рН. Кислотность плодов и овощей обычно определяют методом титрования определенных   объемов   экстракта   раствором   щелочи.   При   этом   титруются исключительно свободные органические кислоты и кислые соли (нейтральные соли не учитываются).  Результаты титрования выражают в процентах для одной из главных органических кислот, входящих в состав объекта. Кислотность свежих плодов груши колеблется от 0,1 до 0,6 %, сливы – 0,4–3,5 %, лимона – 3,8–8 %.  Реактивы   и   материалы:  дистиллированная   вода,   NaOH   или   KOH, фенолфталеин,   фарфоровая   ступка   и   пестик,   кварцевый   песок,   колба Бунзена, конические колбы объемом 250 мл, мерные цилиндры, водяная баня. ХОД РАБОТЫ Взвесить   10–20 г свежих размельченных плодов. Перенести навеску в фарфоровую   ступку   и   тщательно   растереть   с   1–2   г   кварцевого   песка   до однородной массы. Растертую массу количественно перенести в коническую колбу  на 250  мл,  залить  100 мл горячей  дистиллированной   воды (800С)  и нагревать на водяной бане в течение 1 ч при 800С. Затем содержимое колбы охладить и отфильтровать через воронку Шотта. Довести объем экстракта до 100 мл. Пипеткой взять 20 мл вытяжки и перенести в чистую коническую колбу, туда же добавить 2–3 капли фенолфталеина до розового окрашивания. Оттитровать вытяжку 0,1 н раствором щелочи.  Кислотность исследуемого объекта (Х, %) вычислить по формуле:  где   a – количество 0,1 н щелочи, пошедшей на титрование, в мл;  V – общий объем вытяжки;  V 1  – объем вытяжки, взятой для титрования;  m – масса навески, г. Если результат хотят выразить для какой­либо из главных органических кислот, то Х умножают на определенный расчетный коэффициент. Согласно А. И. Ермакову и др., 1 мл 0,1 н раствора щелочи пошедшей на титрование, соответствует   7,5   мг   винной,   6,7   мг   яблочной,   6,4   мг   лимонной,   4,5   мг щавелевой кислот.  Результаты можно оформить в виде таблицы. Выделение липидов из биологических материалов Оборудование,   реактивы:  сушильный   шкаф,   весы   аптечные,   колба коническая на 250 мл, ступка с пестиком, эксикатор, бумага фильтровальная, метанол, хлороформ, ядра орехов, семена подсолнечника.  ХОД РАБОТЫ: 1­1,5 г материала ядер орехов или семян отвесить на аптечных весах, растереть   в   ступке,   затем   перенести   в   высушенные   и   взвешенные   на аналитических весах  пакеты  из плотной фильтровальной  бумаги (10/18см). Взвесить материал вместе с пакетом на аналитических весах и по разности между   полученной   массой   и   массой   пустого   пакета   вычислить   величину навески.   Количество   материала   для   анализа   зависит   от   содержания   в   нём масла. Пакет с навеской вложить в пакет большего размера (его делают из фильтровальной бумаги размером 20/12см) и поместить в коническую колбу ёмкостью 250 мл, залить 35­40 мл метанола и затем прилить в неё 35­40 мл хлороформа. Содержимое колбы перемешать, закрыть корковой пробкой и оставить на неделю в тёмном месте. Пакеты с навесками из одного и того же материала можно помещать в общую склянку. Затем пакет с обезжиренным материалом извлечь из колбы, промыть в хлороформе,   затем   поместить   в   широкий   кристаллизатор   и   поставить   в вытяжной   шкаф,   чтобы   испарился   растворитель.   После   этого   сушить   в течение 2,5 часов в сушильном шкафу 100­105оС. После высушивания пакет поместить в бюкс, охладить в эксикаторе в течение 45 минут и взвесить.  Определение   содержания   воды   в   воздушно   ­   сухом   биологическом материале   проводят   параллельно   с   обезжириванием.   В   сухие   взвешенные бюксы   для   двух   параллельных   определений,   доведённые   до   постоянной массы, поместить по 1г измельчённого материала. После взвешивания бюксы поставить в сушильный шкаф, крышки с бюксов снять и оставить их там же. Сушить 4­6 часов при 100­105оС. Бюксы закрыть крышками и перенести в эксикатор для охлаждения на 45 мин. После охлаждения бюксы взвесить на тех же весах. Затем повторить сушку, помещая бюксы в сушильный шкаф на 30   минут,   охлаждая   и   взвешивая,   пока   разность   между   предыдущим   и последующим взвешиванием не составит 0,0002 г. Вычисление процентного содержания воды производить по формуле: W= 100 (а­а1),%                а где: W­ процентное содержание воды, %;  а­ масса навески до высушивания, г;  а1­ масса навески после высушивания, г. Расчет процентного содержания липидов  в исследуемом материале (на абсолютно сухое вещество) производят  по формуле: [ а  01,01( С  )  вW а ] 100 , % где: а – масса воздушно­сухой навески материала до экстракции, г;        в – масса навески материала после экстракции, г; W­влажность исследуемого материала, %. Сравнительная оценка физико­химических свойств растительных масел Запасные   жиры   растений   представляют   собой   сложные   эфиры многоатомных   спиртов   (в  первую   очередь,  глицерина)   и   жирных   кислот   – триглицериды.   Этерификация   глицерина   может   осуществляться   как   одним типом жирных кислот, так и разными, причем последний вариант наиболее распространен. В том случае, когда все три кислоты насыщенные, образуются твердые жиры, если кислоты ненасыщенные  – жидкие. Растительные жиры чаще всего жидкие, поэтому их именуют маслами. Для жиров (как жидких, так   и   твердых)   характерна   высокая   степень   гидрофобности.   Они   не растворимы в воде, но хорошо растворимы в углеводородах, галагеналканах, спиртах, эфирах. В   числе   компонентов,   входящих в состав растительных масел, всегда присутствует небольшое  количество свободных жирных кислот. Этот   показатель   именуется   кислотным   числом   и   дает   представление   о количестве свободных жирных кислот в масле. В частности, кислотное  число показывает,  сколько  мг  КОН  необходимо  для  нейтрализации свободных жирных   кислот   в   1   г   масла.   Поскольку   при   длительном   хранении   масла происходят процессы окисления, то   содержание свободных жирных кислот со   временем   увеличивается.   Следовательно,   кислотное   число   является важным   показателем   качества   жира.   Другим     физико­химическим показателем,     характеризующим   свойства   жира,  является   число   омыления, которое   показывает   количество   мг   КОН,   необходимое   для   омыления связанных и нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г масла.  О содержании ненасыщенных жирных кислот в жире судят по иодному числу – количеству граммов иода, присоединившемуся к 100 граммам  жира. Определение  физико­химических  показателей  растительного  масла  имеет важное  значение,  так  как  позволяет  контролировать качество получаемого масличного сырья и его изменение при переработке и хранении.  Реактивы   и   материалы:  подсолнечное,   рапсовое,   оливковое   масло, этиловый спирт, КОН, H2SO4  , фенолфталеин, хлороформ, 2,5 % спиртовой раствор   иода,   гипосульфит   натрия,   крахмал,   дистиллированная   вода, конические   колбы,   весы,   микробюретка   для   титрования,   водяная   баня, обратный холодильник.  ХОД РАБОТЫ 1.  Определение кислотного числа  Взвесить   пустую   колбу,   затем   осторожно   туда   добавить   небольшое количество растительного масла (оливковое, подсолнечное, рапсовое). Массу навески определить по разности массы колбы с маслом и пустой колбы.   Приготовить  100  мл  0,2  н  спиртового  раствора  КОН.  Для  этого взвесить 1,12 г щелочи и растворить в минимальном количестве воды (1–1,5 мл). После того как навеска щелочи растворена, довести объем 96 % этанолом до 100 мл. В колбу с маслом прилить 15 мл этанола, добавить 2–3 капли фенолфталеина   и   тщательно   перемешать.   Затем   оттитровать   полученный раствор   0,2   н   спиртовым   раствором   щелочи   до   появления   окрашивания. Титрование  более  слабыми  растворами  КОН  не  дает  видимых изменений окраски и затрудняет определение конца титрования. В качестве контроля оттитровать 15 мл этанола с 2–3 каплями фенолфталеина тем же раствором щелочи.  Кислотное число (КЧ) вычислить по формуле: где   T – титр щелочи (количество КОН в 1 мл раствора), мг;  V   –   объем   раствора   щелочи,   пошедшей   на   титрование   контрольной пробы, мл; V1  – объем раствора щелочи, пошедшей на титрование опытной пробы, мл;  m – масса навески в граммах. 2.  Определение числа омыления  ХОД РАБОТЫ В   конической   колбе   взвесить   навеску   масла   0,2–0,5   г   (как   указано выше),   прилить   15   мл   0,2   н   спиртового   раствора   щелочи   и   нагревать   на водяной     бане     30     мин     с     обратным     холодильником.     Одновременно прокипятить   контрольную   пробу   с   таким   же   количеством   щелочи,   но   не содержащую  масла.  По  истечении  указанного  времени  охладить колбы  с раствором.   При   полном   омылении   на   опытной   колбе   не должно быть блестящих капелек масла, в противном случае омыление надо продолжить. После омыления и охлаждения в колбы добавить 2–3  капли  фенолфталеина и   избыток   щелочи   оттитровать   0,5   н   раствором H 2 SO 4 , пользуясь микробюреткой.  Вычислить число омыления (ЧО) по формуле: где  T – титр щелочи, мг;  V – объем кислоты, пошедшей на титрование контрольной пробы, мл;  V1 –  объем  кислоты,  пошедшей  на  титрование  опытной  пробы, мл;  m – масса навески в граммах.  3. Определение иодного числа  ХОД РАБОТЫ В   коническую   колбу   взвесить   0,1   грамм   жира   и   внести   5   мл хлороформа.   Для   контроля   взять   колбу,   содержащую   только   5   мл хлороформа. В обе колбы прилить по 10 мл 2,5 % спиртового раствора иода, закрыть пробкой, тщательно перемешать и оставить в темной месте на 1   ч при  комнатной  температуре.  По  истечении  указанного  времени избыток иода  оттитровать  0,1н  раствором гипосульфита натрия до желтой окраски. Затем добавить 1 мл 1 % раствора крахмала и продолжить титрование до обесцвечивания раствора. Иодное число (ИЧ) вычислить по формуле:    где  T – титр 0,1 н раствора гипосульфита натрия, мг;  V   –   объем   раствора   гипосульфита,   пошедшего   на   титрование контрольной пробы, мл;  V1   – объем раствора гипосульфита натрия, пошедшей на титрование опытной пробы, мл;  m – масса навески в граммах;  0,0127   –   количество   иода   (г),   эквивалентное   1мл   0,1н   раствора гипосульфита натрия.  Результаты можно оформить в виде таблицы. Определение кальция в биологических материалах. Кальций,   поступающий   в   организм,   в   основном   концентрируется   в костной ткани в виде двойных углекислых, фосфорнокислых и фтористых солей Кальций постоянно присутствует в плазме и сыворотке крови (среднее содержание в сыворотке 9—11 мг%). В крови преобладающая часть кальция (около   60°/о)   находится   в   ионном   состоянии,   а   около   40%   связано   с альбуминами в виде комплексных соединений. Содержание ионов кальция в крови регулируется гормоном паращитовидных желез и тиреокалыцитонином. Кальций   участвует   в   процессе   свертывания   крови;   является активатором   и   ингибитором   ряда   ферментов   (активирует   лецитиназу, аденозинтрифосфатазу,   угнетает   действие   енолазы,   дипептидазы   и   других ферментов). Принцип метода  Кальций осаждают в виде щавелевокислой соли. Осадок растворяют в серной   кислоте,   при   этом   освобождается   эквивалентное   количество щавелевой   кислоты,   которое   оттитровывают   марганцовокислым   калием. Количество   марганцовокислого   калия,   израсходованное   на   титрование, эквивалентно   содержанию   кальция   во   взятом   для   исследования   объеме сыворотки. 1 мл 0,01 н раствора КМп04  соответствует  0,2 мг кальция. Оборудование   и   реактивы:    биологические   жидкости   (вытяжки   из растений, молоко, кровь),  4°/0­ный раствор щавелевокислого аммония,  2°/0­ ный   раствор   аммиака,   1н   раствор   серной   кислоты,  0,01   н   раствор марганцовокислого калия.  ХОД РАБОТЫ В одну центрифужную пробирку вносят о,5г костной ткани   в 1 мл воды, в другую — 1,5 мл дистиллированной воды (контроль). В обе пробирки добавляют   по   1   мл   4%­ного   раствора   щавелевокислого   аммония, перемешивают и оставляют на 30 мин., после чего центрифугируют 10—15 мин.   (2500   оборотов   в   минуту).   Прозрачную   жидкость   над   осадком осторожно отсасывают с помощью стеклянного капилляра или декантируют, стараясь не взмутить осадка. В обе пробирки приливают по 4 мл 2%­ного раствора аммиака для отмывки от избытка щавелевокислого аммония и снова центрифугируют   в   течение   8—10   мин.   Осадок   щавелевокислого   кальция нерастворим   в   щелочной   среде,   но   хорошо   растворяется   в   растворах минеральных кислот. Промывку   осадка   производят   два   раза.   Надосадочную   жидкость тщательно отсасывают или декантируют, в обе пробирки прибавляют по 1 мл 1   н   раствора   серной   кислоты   и   размешивают   тонкими   стеклянными палочками, не вынимая их из пробирок, до полного  растворения осадков. Затем пробирки (с палочками) ставят на 3—4 мин. в горячую водяную баню. Горячие   растворы   титруют   (из   микробюретки)   0,01   н   раствором марганцовокислого   калия,  все  время   помешивая   палочками,  до  появления слаборозового окрашивания, сохраняющегося в течение 1 мин. Содержание кальция в костной ткани или сыворотке крови (мг°/о) х  вычисляют по формуле х=0,2(А—К) 100, где   А   —   количество   0,01   н   раствора   марганцовокислого   калия, израсходованное   на   титрование   опытной   пробы,   мл;  К   —  то   же   при титровании контрольной пробы; 0,2— количество кальция, соответствующее 1 мл 0,01 н раствора марганцовокислого калия, мг. Определение содержания кальция в молоке. Молоко — важный источник кальция и фосфора в питании не только детей, но и взрослых. 78% кальция молока представлено неорганическими солями, 22% соединено с белком казеином. Содержание кальция в молоке определяют методом де­Ваарда . Оборудование и реактивы: молоко разводят в 10 раз (в мерный  цилиндр на 10—25 мл пипеткой вносят 1 мл молока, добавляют 9 мл воды  и тщательно перемешивают), реактивы для определения кальция по  методу де­Ваарда. ХОД РАБОТЫ В одну центрифужную пробирку наливают 1 мл разведенного молока, в другую — 1 мл воды. В обе пробирки наливают по 0,5 мл 4%­ного раствора щавелевокислого аммония размешивают тонкими стеклянными палочками, не вынимая их из пробирок, до полного растворения осадков. Далее поступают так, как в предыдущей работе. Горячие растворы титруют (из микробюретки) 0,01 н раствором марганцовокислого калия, все время помешивая палочками, до появления слаборозового окрашивания, сохраняющегося в течение 1 мин. Содержание кальция в молоке (мг°/о) х вычисляют по формуле х=0,2(А—К) 100 / 0,1 где   А   —   количество   0,01   н   раствора   марганцовокислого   калия, израсходованное   на   титрование   опытной   пробы,   мл;  К   —  то   же   при титровании контрольной пробы; 0,2— количество кальция, соответствующее 1 мл 0,01 н раствора марганцовокислого калия, мг, 0,1 содержание молока в разбавленном растворе. Определение йода в продуктах питания Методика определения йода в продуктах питания  Оборудование  и  реактивы:   колбы   вместимостью   250   мл,  1н   раствор серной кислоты, пипетки 5мл, 10% раствор иодида калия, 1%­ный раствор крахмала. ХОД РАБОТЫ Навеску исследуемой пробы массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью   250см3  и   растворяют   в   100   cм3  дистиллированной   воды.   К полученному раствору прибавляют  1мл 1н раствора  серной кислоты, 5 мл 10%   раствора   иодида   калия,   перемешивают,   закрывают   колбу   пробкой   и помещают   ее   на   сутки   в   темное   место.   По   истечении   времени   колбу извлекают, добавляют 1 мл 1 %­ного раствора крахмала, по интенсивности окраски определяют качественное наличие йода в данном продукте. 2NaI + 2H2SO4 = I2 + SO2 + Na2SO4 + 2H2O  Исследуемый материал груша, яблоко, ламинария и другие  биологические материалы. ПРИМЕРНЫЕ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЙ РЕФЕРАТИВНОГО ХАРАКТЕРА 1.   Принципы   классификации   природных   химических   соединений растений.  2. Простейшие  бифункциональные  соединения  –  мостик  к  массиву  природных соединений.  3. История развития биологической химии растений.  4. Мир растений – как источник сырья и ресурсов.  5. Связь биохимии растений и биотехнологии.  6. Флавоноиды растений: природа, распространение и функции.  7. Алкалоиды растений и их практическое использование.  8. Растительные  яды,  возможности  их  использования  в  медицине  и  научной деятельности.  9. Наркотические  вещества  растительного  происхождения,  методы  их обнаружения в биологических образцах.   10. Природа и биологическая активность эфирных масел растений.  11. Функции вторичных метаболитов в растительном царстве.  12. История развития витаминологии.  13.  Открытие витамина С и установление его структуры.  14. Окислительно­восстановительные реакции витамина С.  15. Качественное и количественное определение содержания витаминов группы В в растительных объектах.